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zhou325912

铜虫 (小有名气)

[求助] 双酶切怎么操作才能完全彻底呢! 已有7人参与

我现在正在做双酶切连接,用的是NcoI和PstI这两个酶,首先我是将连有目的基因的质粒进行双酶切,然后将新的片段经双酶切之后连入目的载体(新片段和原来质粒上的片段大小一样,片段1.5kb,质粒剩下部分为6.8kb)转化有转化子,菌落PCR验证正确,但是拿了8个转化子提质粒测序之后发现全是之前的那个旧质粒,现在怀疑是质粒双酶切没有切完全,请问我应该怎么操作才能尽可能保证酶切完全呢
已经纠结了很长时间了,求大神指点
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Lylissa

新虫 (初入文坛)

带有目的基因的质粒双酶切之后,需要跑胶将空载进行酶切回收,再与双酶切后的新片段进行连接。
如果菌落PCR验证之后是阳性结果,建议提取质粒后再进行酶切验证,与空载进行对比,可以知道片段到底是连没连上去。
8楼2015-03-10 11:32:34
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去哪里看海

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-10 10:38:57
简单说就是没有连上对吧?我觉得可以从几个方面找原因,比如,片段与质粒的酶切是否充分,片段的浓度与回收状态,质粒的浓度,现在就是你的目的片段和被替代的片段大小一致,所以跑胶看不出来,如果菌批验证,那引物的设计有没有问题?不能P全长的。
2楼2015-03-09 10:26:32
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-10 10:39:00
菌落PCR你用什么引物,不要用自己的引物,要用通用引物(至少用一头)。我以前试过,用 自己的引物可能得到验证条带大小对,但实际上是假的。
3楼2015-03-09 11:22:47
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-10 10:39:04
双酶切之后先跑胶看看是否已经完全酶切,若没有就继续切,如完全切开了就低电压长时间跑胶,分离,回收再连接。
鉴定的时候,找一个目的片段里面有但原来那个1.5KB片段没有的酶切位点+载体上的酶切位点双酶切看看是否与自己分析的一致。一致就测序,不一致就错,不用PCR,麻烦。即使PCR,还是要酶切,麻烦。
是否看懂?
4楼2015-03-09 16:52:16
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