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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 请问有人用双酶切过petduet-1载体吗？用bamHI和Hind3 双酶切
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飘零星lin

金虫 (小有名气)

[求助] 请问有人用双酶切过petduet-1载体吗？用bamHI和Hind3 双酶切已有2人参与

用bamHI和Hind3 双酶切空载体petduet-1，thermo公司的酶，怎么才可以知道切完全？我要将一个300bp的小片段insert,转化后电泳一直条带位置不对，理论应该跑得更慢，结果比原质粒跑快了很多。不明所以。求经验分享！谢谢大家。在转化之前有没有什么办法判断酶切成功？
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1楼2014-05-07 12:14:27
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-07 15:25:03
转化之前证实双酶切完全与否不太容易，因为空载体的双酶切与单酶切在普通电泳上很难区分开，那个小片段很可能跑不出条带，PAGE电泳可以试试
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只有不断地失败才会成功
2楼2014-05-07 15:16:37
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-07 19:05:59
你先提高酶切质粒和酶切目的片段浓度，按你的经验觉得切开后，T4连接酶连接过夜，然后跑胶，你会看见不同的几条带，有自连的，有没连接上的目的片段和载体片段，有你需要连接有目的片段的载体，然后根据你的bp量大小，胶回收所需条带，再转染感受态，涂板，培养，这样试试看。
  希望对你有帮助。
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3楼2014-05-07 16:17:57
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飘零星lin

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-05-07 16:17:57
你先提高酶切质粒和酶切目的片段浓度，按你的经验觉得切开后，T4连接酶连接过夜，然后跑胶，你会看见不同的几条带，有自连的，有没连接上的目的片段和载体片段，有你需要连接有目的片段的载体，然后根据你的bp量大小 ...

pcr目的片段用同一条件双酶切可以看到切下来的100多bp,是否可以证明同一条件酶切的空载体也酶切完全？另外，我跑电泳的时候，30min的时候我看到条带位置在5000以下，但是再跑10min条带位置在5000以上，这样正常吗？
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4楼2014-05-07 17:27:46
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飘零星lin

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zep616745243 at 2014-05-07 15:16:37
转化之前证实双酶切完全与否不太容易，因为空载体的双酶切与单酶切在普通电泳上很难区分开，那个小片段很可能跑不出条带，PAGE电泳可以试试

实在不行可以一试，谢谢
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5楼2014-05-07 17:51:52
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-07 19:06:03
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飘零星lin at 2014-05-07 17:27:46
pcr目的片段用同一条件双酶切可以看到切下来的100多bp,是否可以证明同一条件酶切的空载体也酶切完全？另外，我跑电泳的时候，30min的时候我看到条带位置在5000以下，但是再跑10min条带位置在5000以上，这样正常吗？...

问题一：不一定，因为你加的PCR片段浓度和你载体浓度不等
问题二：如果是在5000上下相差不远的话，是在正常范围内
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6楼2014-05-07 18:00:29
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