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飘零星lin

金虫 (小有名气)

[求助] 请问有人用双酶切过petduet-1载体吗?用bamHI和Hind3 双酶切 已有2人参与

用bamHI和Hind3 双酶切空载体petduet-1,thermo公司的酶,怎么才可以知道切完全?我要将一个300bp的小片段insert,转化后电泳一直条带位置不对,理论应该跑得更慢,结果比原质粒跑快了很多。不明所以。求经验分享!谢谢大家。在转化之前有没有什么办法判断酶切成功?
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-07 15:25:03
转化之前证实双酶切完全与否不太容易,因为空载体的双酶切与单酶切在普通电泳上很难区分开,那个小片段很可能跑不出条带,PAGE电泳可以试试
只有不断地失败才会成功
2楼2014-05-07 15:16:37
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-07 19:05:59
你先提高酶切质粒和酶切目的片段浓度,按你的经验觉得切开后,T4连接酶连接过夜,然后跑胶,你会看见不同的几条带,有自连的,有没连接上的目的片段和载体片段,有你需要连接有目的片段的载体,然后根据你的bp量大小,胶回收所需条带,再转染感受态,涂板,培养,这样试试看。
  希望对你有帮助。
3楼2014-05-07 16:17:57
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飘零星lin

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-05-07 16:17:57
你先提高酶切质粒和酶切目的片段浓度,按你的经验觉得切开后,T4连接酶连接过夜,然后跑胶,你会看见不同的几条带,有自连的,有没连接上的目的片段和载体片段,有你需要连接有目的片段的载体,然后根据你的bp量大小 ...

pcr目的片段用同一条件双酶切可以看到切下来的100多bp,是否可以证明同一条件酶切的空载体也酶切完全?另外,我跑电泳的时候,30min的时候我看到条带位置在5000以下,但是再跑10min条带位置在5000以上,这样正常吗?
4楼2014-05-07 17:27:46
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飘零星lin

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zep616745243 at 2014-05-07 15:16:37
转化之前证实双酶切完全与否不太容易,因为空载体的双酶切与单酶切在普通电泳上很难区分开,那个小片段很可能跑不出条带,PAGE电泳可以试试

实在不行可以一试,谢谢
5楼2014-05-07 17:51:52
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-07 19:06:03
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飘零星lin at 2014-05-07 17:27:46
pcr目的片段用同一条件双酶切可以看到切下来的100多bp,是否可以证明同一条件酶切的空载体也酶切完全?另外,我跑电泳的时候,30min的时候我看到条带位置在5000以下,但是再跑10min条带位置在5000以上,这样正常吗?...

问题一:不一定,因为你加的PCR片段浓度和你载体浓度不等
问题二:如果是在5000上下相差不远的话,是在正常范围内
6楼2014-05-07 18:00:29
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