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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切之后怎么知道切开了呢？
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lialee22

木虫 (著名写手)

黑钻会员

[求助] 双酶切之后怎么知道切开了呢？ 已有4人参与

pET-28a(+)，酶切位点为 Nde I 和 Not I 。两个位点之间只有70bp。

双酶切之后我怎么知道切开了呢？

跑电泳的时候70bp早就跑出去了。

用单酶切做对照，也不行。

有什么办法吗？
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诸事顺遂
1楼 2014-05-22 18:06:15
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
测序！

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2楼2014-05-22 18:10:50
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HYZ221314

至尊木虫 (职业作家)

优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lialee22(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-27 21:10:19
有两个酶切位点，如果都切成功，正常应该是两天带，因为质粒是环状的；如果单酶切，那就得看你质粒的长度和酶切位点咯，但是只是一条带

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青山不断，绿水长流
3楼2014-05-22 18:13:07
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jonew

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你电泳的时候干嘛非得跑完呢？ 2000MARKER 点一点  然后跑上五六分钟 看看有没有没有 不就行了？ 然后接着跑  看看剩下的啊
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借口很贱，，，
4楼2014-05-22 21:27:11
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穆忆枫

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lialee22(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-27 21:10:31
告诉你，双酶切如果中间只有70bp那你就别想看到两条带，你双酶切时间久点，跟原质粒对照，只要两个酶在通用buffer中活性很高的话，会切开，你在连接片段，应该会成功，如果切太大量的话，一是浪费，二是也不一定可以看到小条带。建议，双酶切时间久点，在后面你构建质粒后还有测序保证呢。
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5楼2014-05-23 13:08:38
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lialee22

木虫 (著名写手)

黑钻会员
引用回帖:
4楼: Originally posted by jonew at 2014-05-22 21:27:11
你电泳的时候干嘛非得跑完呢？ 2000MARKER 点一点  然后跑上五六分钟 看看有没有没有 不就行了？ 然后接着跑  看看剩下的啊

在EB里泡过再放回缓冲液里么？
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诸事顺遂
6楼2014-05-27 20:09:44
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lialee22

木虫 (著名写手)

黑钻会员
引用回帖:
5楼: Originally posted by 穆忆枫 at 2014-05-23 13:08:38
告诉你，双酶切如果中间只有70bp那你就别想看到两条带，你双酶切时间久点，跟原质粒对照，只要两个酶在通用buffer中活性很高的话，会切开，你在连接片段，应该会成功，如果切太大量的话，一是浪费，二是也不一定可以 ...

我听说切太久会“乱切”呐……
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诸事顺遂
7楼2014-05-27 20:10:48
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DAX1

新虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-27 21:10:54
引用回帖:
7楼: Originally posted by lialee22 at 2014-05-27 20:10:48
我听说切太久会“乱切”呐……...

那叫星活性（star activity)吧？有星活性的酶都会标识出来的，双酶切只要你buffer选对了，基本都会切开的，没必要检测。如果你非要检测的话，把那条带回收，做个自连转化，长克隆就是单酶切，没有就是切完全了
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8楼2014-05-27 20:28:46
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lialee22 at 2014-05-27 20:09:44
在EB里泡过再放回缓冲液里么？...

我们是将EB直接加入到胶里面去  直接跑完就去照相   哪如果你们跑一块胶 跑的不理想  就是条带没有分开  你们把胶怎么办呢？
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借口很贱，，，
9楼2014-05-27 21:52:19
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lialee22 at 2014-05-27 20:10:48
我听说切太久会“乱切”呐……...

一般不会发生星活性吧 切2-3小时应该不会。。。
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借口很贱，，，
10楼2014-05-27 21:54:12
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