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lialee22

木虫 (著名写手)

黑钻会员

[求助] 双酶切之后怎么知道切开了呢?已有4人参与

pET-28a(+),酶切位点为 Nde I 和 Not I 。两个位点之间只有70bp。

双酶切之后我怎么知道切开了呢?

跑电泳的时候70bp早就跑出去了。

用单酶切做对照,也不行。

有什么办法吗?
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长得丑还想得美
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

测序!

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-05-22 18:10:50
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HYZ221314

至尊木虫 (职业作家)

优秀版主

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lialee22(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-27 21:10:19
有两个酶切位点,如果都切成功,正常应该是两天带,因为质粒是环状的;如果单酶切,那就得看你质粒的长度和酶切位点咯,但是只是一条带

[ 发自小木虫客户端 ]
青山不断,绿水长流
3楼2014-05-22 18:13:07
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jonew

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你电泳的时候干嘛非得跑完呢? 2000MARKER 点一点  然后跑上五六分钟 看看有没有没有 不就行了? 然后接着跑  看看剩下的啊
借口很贱,,,
4楼2014-05-22 21:27:11
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穆忆枫

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lialee22(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-27 21:10:31
告诉你,双酶切如果中间只有70bp那你就别想看到两条带,你双酶切时间久点,跟原质粒对照,只要两个酶在通用buffer中活性很高的话,会切开,你在连接片段,应该会成功,如果切太大量的话,一是浪费,二是也不一定可以看到小条带。建议,双酶切时间久点,在后面你构建质粒后还有测序保证呢。
5楼2014-05-23 13:08:38
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lialee22

木虫 (著名写手)

黑钻会员

引用回帖:
4楼: Originally posted by jonew at 2014-05-22 21:27:11
你电泳的时候干嘛非得跑完呢? 2000MARKER 点一点  然后跑上五六分钟 看看有没有没有 不就行了? 然后接着跑  看看剩下的啊

在EB里泡过再放回缓冲液里么?
长得丑还想得美
6楼2014-05-27 20:09:44
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lialee22

木虫 (著名写手)

黑钻会员

引用回帖:
5楼: Originally posted by 穆忆枫 at 2014-05-23 13:08:38
告诉你,双酶切如果中间只有70bp那你就别想看到两条带,你双酶切时间久点,跟原质粒对照,只要两个酶在通用buffer中活性很高的话,会切开,你在连接片段,应该会成功,如果切太大量的话,一是浪费,二是也不一定可以 ...

我听说切太久会“乱切”呐……
长得丑还想得美
7楼2014-05-27 20:10:48
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DAX1

新虫 (小有名气)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-27 21:10:54
引用回帖:
7楼: Originally posted by lialee22 at 2014-05-27 20:10:48
我听说切太久会“乱切”呐……...

那叫星活性(star activity)吧?有星活性的酶都会标识出来的,双酶切只要你buffer选对了,基本都会切开的,没必要检测。如果你非要检测的话,把那条带回收,做个自连转化,长克隆就是单酶切,没有就是切完全了
8楼2014-05-27 20:28:46
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jonew

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lialee22 at 2014-05-27 20:09:44
在EB里泡过再放回缓冲液里么?...

我们是将EB直接加入到胶里面去  直接跑完就去照相   哪如果你们跑一块胶 跑的不理想  就是条带没有分开  你们把胶怎么办呢?
借口很贱,,,
9楼2014-05-27 21:52:19
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jonew

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by lialee22 at 2014-05-27 20:10:48
我听说切太久会“乱切”呐……...

一般不会发生星活性吧 切2-3小时应该不会。。。
借口很贱,,,
10楼2014-05-27 21:54:12
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