| 查看: 2498 | 回复: 14 | ||
[求助]
请教——质粒双酶切问题 已有4人参与
|
||
|
我的目的是想把片段C插入载体A（A长度4.2Kb）中，酶切位点是 xbaI 和 xhoI 我是这样做的： 先把另一个已经构建好了的片段B（900bp左右）插入A的质粒（插入的时候也是用xbaI 和 xhoI)双酶切 切下片段跑胶验证了，一个4.2Kb左右，一个900bp左右，我把4.2kb的条带A切下回收 用回收后的A与C连接转化，A与水作为自连对照 现在的问题是自连对照（100多个克隆）长的菌比连接的（50个克隆左右）都多，还有无意义去验证连接成功否？ 另外，既然双酶切切开了，大小条带都对，为什么自连对照会有那么多克隆呢？ |
回复此楼» 猜你喜欢
科研人必读：新一代 KRAS G12C 抑制剂 Olomorasib 的研究进展
已经有0人回复
-
BT-11（Omilancor）研究化合物全解析：从分子结构到实验应用要点
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有288人回复
-
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
-
RO4929097 解析：双苯并氮杂䓬骨架与 Notch 通路实验设计要点
已经有0人回复
-
分子量 1157 的 PROTAC 怎么配不析出：SGK3-PROTAC1 的溶解、分装与图谱复核
已经有0人回复
-
logP 6.1 的羧酸怎么配母液：GSK 650394 的溶解窗口与稀释顺序
已经有0人回复
-
从"水不溶"到 71 mg/mL：雷特格韦的 pH 依赖溶解与螯合色谱边界
已经有0人回复
-
133 Ų 的极性表面积，如何决定 TNG462 的母液配制与色谱条件
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 双酶切后，质粒条带弥散
已经有13人回复
- 重组质粒双酶切后没有条带
已经有20人回复
- 提取重组质粒进行双酶切之后什么条带也没有，怎么回事？？
已经有7人回复
- 质粒酶切拖尾，附图。
已经有3人回复
- 双酶切之后，线状质粒的连接问题
已经有13人回复
- 空质粒双酶切后大小不对，纠结！
已经有11人回复
- 质粒双酶切。。。。。。。
已经有5人回复
- 双酶切没有切开，怎么回事啊
已经有6人回复
- pGEM-T质粒酶切时遇到的一些问题
已经有11人回复
- 测序正确的质粒用SfiI酶切不动，请问有什么相关文献吗
已经有6人回复
- 质粒PCR大小正确，可是双酶切切不开
已经有8人回复
- 求助：重组质粒酶切问题！请大家帮我解决一下，急！
已经有7人回复
- 求助：关于BamHI SalI 双酶切的问题
已经有16人回复
- 双酶切，体系，切不出来
已经有10人回复
- 质粒双酶切问题
已经有16人回复
- 【求助/交流】双酶切电泳条带拖尾严重，什么原因啊？
已经有9人回复
- 【求助/交流】求助、质粒酶切没有条带？
已经有18人回复
- 【求助/交流】帮我看一下质粒单双酶切图！
已经有29人回复
- 【求助/交流】质粒pPICZA酶切问题
已经有5人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cailand: 金币+3, ★★★★★最佳答案, 专业！ 2014-03-28 17:57:24
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-29 21:38:12
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-29 21:41:01
感谢参与，应助指数 +1
cailand: 金币+3, ★★★★★最佳答案, 专业！ 2014-03-28 17:57:24
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-29 21:38:12
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-29 21:41:01
|
建议你进行验证，做个PCR test。 载体的自连不一定是在试管里发生的 线性的DNA也可以进行转化（单酶切后的质粒直接转化细菌也是可以长点的，效率稍微低一点而已） 线性化的质粒进入细胞后，虽然是粘末端，也可以被细菌的DNA酶平齐化，之后再连接。 至于为什么载体自连比加入了片段的还多，这个不好解释。 但是，关键在于，加入了片段后的结果和未加片段的结果不一样了(100 vs. 50)，这一点就是继续进行检测的理由。 如果你觉得理由不充分的话，可以优化一下载体和片段的比例，一般来说，减少片段的用量会好一些（因为大部分的情况是载体浓了） |
2楼2014-03-28 17:51:33
3楼2014-03-28 18:05:45
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3101.7
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 187.5小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
8楼2014-03-29 09:51:04
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3101.7
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 187.5小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
4楼2014-03-28 19:03:06
5楼2014-03-28 19:20:18
6楼2014-03-28 19:22:59
lvbobo823
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 363 (硕士)
- 金币: 7753.3
- 散金: 15
- 红花: 9
- 帖子: 751
- 在线: 189.4小时
- 虫号: 819723
- 注册: 2009-07-31
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
7楼2014-03-28 21:22:35
怎么都行
银虫 (小有名气)
- 应助: 21 (小学生)
- 金币: 591.8
- 散金: 45
- 帖子: 229
- 在线: 38.2小时
- 虫号: 1050090
- 注册: 2010-06-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
9楼2014-03-29 21:26:29
neuralcrest
金虫 (正式写手)
- 应助: 19 (小学生)
- 金币: 609.5
- 散金: 928
- 红花: 5
- 帖子: 923
- 在线: 353.6小时
- 虫号: 1668292
- 注册: 2012-03-06
- 性别: GG
- 专业: 细胞增殖、生长与分化
10楼2014-03-30 10:44:48
