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汕头大学海洋科学接受调剂
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cailand

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教——质粒双酶切问题 已有4人参与

我的目的是想把片段C插入载体A(A长度4.2Kb)中,酶切位点是 xbaI 和 xhoI

我是这样做的:

先把另一个已经构建好了的片段B(900bp左右)插入A的质粒(插入的时候也是用xbaI 和 xhoI)双酶切

切下片段跑胶验证了,一个4.2Kb左右,一个900bp左右,我把4.2kb的条带A切下回收

用回收后的A与C连接转化,A与水作为自连对照

现在的问题是自连对照(100多个克隆)长的菌比连接的(50个克隆左右)都多,还有无意义去验证连接成功否?

另外,既然双酶切切开了,大小条带都对,为什么自连对照会有那么多克隆呢?
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woolley

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by woolley at 2014-03-28 17:51:33
建议你进行验证,做个PCR test。
载体的自连不一定是在试管里发生的
线性的DNA也可以进行转化(单酶切后的质粒直接转化细菌也是可以长点的,效率稍微低一点而已)
线性化的质粒进入细胞后,虽然是粘末端,也可以 ...

最后一句话应该是“减少载体的用量会好一些”
3楼2014-03-28 18:05:45
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cailand: 金币+3, ★★★★★最佳答案, 专业! 2014-03-28 17:57:24
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-29 21:38:12
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-29 21:41:01
建议你进行验证,做个PCR test。
载体的自连不一定是在试管里发生的
线性的DNA也可以进行转化(单酶切后的质粒直接转化细菌也是可以长点的,效率稍微低一点而已)
线性化的质粒进入细胞后,虽然是粘末端,也可以被细菌的DNA酶平齐化,之后再连接。
至于为什么载体自连比加入了片段的还多,这个不好解释。
但是,关键在于,加入了片段后的结果和未加片段的结果不一样了(100 vs. 50),这一点就是继续进行检测的理由。
如果你觉得理由不充分的话,可以优化一下载体和片段的比例,一般来说,减少片段的用量会好一些(因为大部分的情况是载体浓了)
2楼2014-03-28 17:51:33
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

★ ★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-29 21:39:19
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-29 21:40:59
现在的问题是自连对照(100多个克隆)长的菌比连接的(50个克隆左右)都多,最大的可能就是载体没有切完全。或者挖胶时污染了。
4楼2014-03-28 19:03:06
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cailand

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by woolley at 2014-03-28 18:05:45
最后一句话应该是“减少载体的用量会好一些”...

看得出来笔误,谢谢了!
5楼2014-03-28 19:20:18
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