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请教——质粒双酶切问题 已有4人参与
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我的目的是想把片段C插入载体A（A长度4.2Kb）中，酶切位点是 xbaI 和 xhoI 我是这样做的： 先把另一个已经构建好了的片段B（900bp左右）插入A的质粒（插入的时候也是用xbaI 和 xhoI)双酶切 切下片段跑胶验证了，一个4.2Kb左右，一个900bp左右，我把4.2kb的条带A切下回收 用回收后的A与C连接转化，A与水作为自连对照 现在的问题是自连对照（100多个克隆）长的菌比连接的（50个克隆左右）都多，还有无意义去验证连接成功否？ 另外，既然双酶切切开了，大小条带都对，为什么自连对照会有那么多克隆呢？ |
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建议你进行验证，做个PCR test。 载体的自连不一定是在试管里发生的 线性的DNA也可以进行转化（单酶切后的质粒直接转化细菌也是可以长点的，效率稍微低一点而已） 线性化的质粒进入细胞后，虽然是粘末端，也可以被细菌的DNA酶平齐化，之后再连接。 至于为什么载体自连比加入了片段的还多，这个不好解释。 但是，关键在于，加入了片段后的结果和未加片段的结果不一样了(100 vs. 50)，这一点就是继续进行检测的理由。 如果你觉得理由不充分的话，可以优化一下载体和片段的比例，一般来说，减少片段的用量会好一些（因为大部分的情况是载体浓了） |
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