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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教——质粒双酶切问题
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cailand

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教——质粒双酶切问题 已有4人参与

我的目的是想把片段C插入载体A（A长度4.2Kb）中，酶切位点是 xbaI 和 xhoI

我是这样做的：

先把另一个已经构建好了的片段B（900bp左右）插入A的质粒（插入的时候也是用xbaI 和 xhoI)双酶切

切下片段跑胶验证了，一个4.2Kb左右，一个900bp左右，我把4.2kb的条带A切下回收

用回收后的A与C连接转化，A与水作为自连对照

现在的问题是自连对照（100多个克隆）长的菌比连接的（50个克隆左右）都多，还有无意义去验证连接成功否？

另外，既然双酶切切开了，大小条带都对，为什么自连对照会有那么多克隆呢？
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1楼 2014-03-28 17:08:03
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cailand at 2014-03-28 19:22:59
请教，没切完全的话大小还会在4.2的位置上吗？

切得比较完全，没有其他条带了

污染也许有可能，谢谢了！...

900bp有点小，4.2K跑胶时间不长的话，载体跟线性化的质粒是分不很清楚的，这时挖胶就有可能把线性质粒挖上了。
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8楼2014-03-29 09:51:04
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cailand: 金币+3, ★★★★★最佳答案, 专业！ 2014-03-28 17:57:24
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-29 21:38:12
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-29 21:41:01
建议你进行验证，做个PCR test。
载体的自连不一定是在试管里发生的
线性的DNA也可以进行转化（单酶切后的质粒直接转化细菌也是可以长点的，效率稍微低一点而已）
线性化的质粒进入细胞后，虽然是粘末端，也可以被细菌的DNA酶平齐化，之后再连接。
至于为什么载体自连比加入了片段的还多，这个不好解释。
但是，关键在于，加入了片段后的结果和未加片段的结果不一样了(100 vs. 50)，这一点就是继续进行检测的理由。
如果你觉得理由不充分的话，可以优化一下载体和片段的比例，一般来说，减少片段的用量会好一些（因为大部分的情况是载体浓了）
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2楼2014-03-28 17:51:33
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woolley

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by woolley at 2014-03-28 17:51:33
建议你进行验证，做个PCR test。
载体的自连不一定是在试管里发生的
线性的DNA也可以进行转化（单酶切后的质粒直接转化细菌也是可以长点的，效率稍微低一点而已）
线性化的质粒进入细胞后，虽然是粘末端，也可以 ...

最后一句话应该是“减少载体的用量会好一些”
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3楼2014-03-28 18:05:45
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-29 21:39:19
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-29 21:40:59
现在的问题是自连对照（100多个克隆）长的菌比连接的（50个克隆左右）都多，最大的可能就是载体没有切完全。或者挖胶时污染了。
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4楼2014-03-28 19:03:06
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