24小时热门版块排行榜    

查看: 3308  |  回复: 10

lialee22

木虫 (著名写手)

黑钻会员

[求助] 双酶切之后怎么知道切开了呢? 已有4人参与

pET-28a(+),酶切位点为 Nde I 和 Not I 。两个位点之间只有70bp。

双酶切之后我怎么知道切开了呢?

跑电泳的时候70bp早就跑出去了。

用单酶切做对照,也不行。

有什么办法吗?
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

诸事顺遂
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

测序!

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-05-22 18:10:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

HYZ221314

至尊木虫 (职业作家)

优秀版主

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lialee22(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-27 21:10:19
有两个酶切位点,如果都切成功,正常应该是两天带,因为质粒是环状的;如果单酶切,那就得看你质粒的长度和酶切位点咯,但是只是一条带

[ 发自小木虫客户端 ]
青山不断,绿水长流
3楼2014-05-22 18:13:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jonew

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你电泳的时候干嘛非得跑完呢? 2000MARKER 点一点  然后跑上五六分钟 看看有没有没有 不就行了? 然后接着跑  看看剩下的啊
借口很贱,,,
4楼2014-05-22 21:27:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

穆忆枫

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lialee22(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-27 21:10:31
告诉你,双酶切如果中间只有70bp那你就别想看到两条带,你双酶切时间久点,跟原质粒对照,只要两个酶在通用buffer中活性很高的话,会切开,你在连接片段,应该会成功,如果切太大量的话,一是浪费,二是也不一定可以看到小条带。建议,双酶切时间久点,在后面你构建质粒后还有测序保证呢。
5楼2014-05-23 13:08:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lialee22

木虫 (著名写手)

黑钻会员

引用回帖:
4楼: Originally posted by jonew at 2014-05-22 21:27:11
你电泳的时候干嘛非得跑完呢? 2000MARKER 点一点  然后跑上五六分钟 看看有没有没有 不就行了? 然后接着跑  看看剩下的啊

在EB里泡过再放回缓冲液里么?
诸事顺遂
6楼2014-05-27 20:09:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lialee22

木虫 (著名写手)

黑钻会员

引用回帖:
5楼: Originally posted by 穆忆枫 at 2014-05-23 13:08:38
告诉你,双酶切如果中间只有70bp那你就别想看到两条带,你双酶切时间久点,跟原质粒对照,只要两个酶在通用buffer中活性很高的话,会切开,你在连接片段,应该会成功,如果切太大量的话,一是浪费,二是也不一定可以 ...

我听说切太久会“乱切”呐……
诸事顺遂
7楼2014-05-27 20:10:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

DAX1

新虫 (小有名气)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-27 21:10:54
引用回帖:
7楼: Originally posted by lialee22 at 2014-05-27 20:10:48
我听说切太久会“乱切”呐……...

那叫星活性(star activity)吧?有星活性的酶都会标识出来的,双酶切只要你buffer选对了,基本都会切开的,没必要检测。如果你非要检测的话,把那条带回收,做个自连转化,长克隆就是单酶切,没有就是切完全了
8楼2014-05-27 20:28:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jonew

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lialee22 at 2014-05-27 20:09:44
在EB里泡过再放回缓冲液里么?...

我们是将EB直接加入到胶里面去  直接跑完就去照相   哪如果你们跑一块胶 跑的不理想  就是条带没有分开  你们把胶怎么办呢?
借口很贱,,,
9楼2014-05-27 21:52:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jonew

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by lialee22 at 2014-05-27 20:10:48
我听说切太久会“乱切”呐……...

一般不会发生星活性吧 切2-3小时应该不会。。。
借口很贱,,,
10楼2014-05-27 21:54:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 脆桃万岁! 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 349求调剂 +3 杰斯塔里斯 2026-03-21 3/150 2026-03-26 20:47 by fmesaito
[考研] 一志愿 西北大学 ,070300化学学硕,总分287,双非一本,求调剂。 +6 晨昏线与星海 2026-03-20 6/300 2026-03-26 19:20 by macy2011
[考研] 085600材料与化工306 +7 z1z2z3879 2026-03-21 7/350 2026-03-26 17:59 by fmesaito
[考研] 材料科学与工程 317求调剂 +4 JKSOIID 2026-03-26 4/200 2026-03-26 15:58 by 不吃魚的貓
[考研] 281求调剂 +6 Koxui 2026-03-24 7/350 2026-03-26 15:37 by 无际的草原
[考研] 一志愿河工大 081700 276求调剂 +4 地球绕着太阳转 2026-03-23 4/200 2026-03-26 14:27 by zzll406
[考研] 332求调剂 +6 032500 2026-03-25 6/300 2026-03-25 22:45 by 418490947
[考研] 290分调剂求助 +3 吉祥止止陈 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:58 by barlinike
[考研] 招08考数学 +8 laoshidan 2026-03-20 17/850 2026-03-25 17:52 by 一个红太阳
[考研] 0854电子信息求调剂 324 +4 Promise-jyl 2026-03-23 4/200 2026-03-25 11:36 by Sugarlight
[考研] 307求调剂 +3 余意卿 2026-03-21 6/300 2026-03-24 15:03 by 余意卿
[考研] 一志愿山东大学药学学硕求调剂 +3 开开心心没烦恼 2026-03-23 4/200 2026-03-24 00:06 by 开开心心没烦恼
[考研] 一志愿国科过程所081700,274求调剂 +3 三水研0水立方 2026-03-23 3/150 2026-03-23 23:11 by MajorWen
[考研] 材料与化工085600,总分304,本科有两篇sci参与,求调剂 +4 幸运的酱酱 2026-03-22 5/250 2026-03-22 20:15 by edmund7
[考研] 324求调剂 +6 lucky呀呀呀鸭 2026-03-20 6/300 2026-03-22 16:01 by ColorlessPI
[考研] 生物学调剂 +5 Surekei 2026-03-21 5/250 2026-03-22 14:39 by tcx007
[考研] 一志愿南大,0703化学,分数336,求调剂 +3 收到VS 2026-03-21 3/150 2026-03-21 18:42 by 学员8dgXkO
[考研] 266求调剂 +3 哇呼哼呼哼 2026-03-20 3/150 2026-03-21 16:46 by barlinike
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境总分308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-20 7/350 2026-03-21 16:36 by barlinike
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
信息提示
请填处理意见