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stardu

新虫 (初入文坛)

[求助] 有没有用过XmnI这个酶的?酶切后连接需要注意什么问题么?

我用XmnI做酶切后与质粒pKD46载体连接,但是连了将近4个月了,总是连不上。有没有人做过这类的实验?这个酶切出的是平末端。还有连接时有没有需要注意的问题?这个质粒是温敏型质粒,培养时都是在30摄氏度养的。
  有做过类似实验的高手们,请赐教!小女子在这里拜谢了!我真的快要疯了!
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stardu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-12-29 15:26:50
你是换抗生素的抗性吧?这个载体我还真这么做过,首先,平末端连接的比例,目的片段:载体=10:1吧,连接酶多加点,然后16度过夜吧,如果你是pcr产物连的话,切记载体不能去磷酸化,因为pcr片段没有磷酸集团,如果你 ...

对的,是换抗生素的抗性。我的比例是3:1,看来需要调整一下比例。我是先连到T载上再做的,载体没有去磷酸化。我用没有去磷酸化的pKD46质粒自连都没有长。
真的是太感谢你了!我调整连接比例再做一下。另外想问一下,连接后培养的温度与转速影响大么?用37℃还是30℃呢?谢谢你!
4楼2012-12-29 15:42:06
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
stardu: 金币+3, 有帮助 2012-12-29 16:11:21
目的片段的酶切位点是在末端吗?这个酶没人试过要加多少保护碱基,切割效率不好说啊。如果是PCR产物直接和载体连,需要磷酸化。对载体的酶切时间不要过长,电泳证明切开就可以了,不推荐切过夜。此外载体去磷酸化处理,连接时加大目的片段:载体的比例,16度连过夜应该没问题的。
2楼2012-12-29 11:03:52
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你是换抗生素的抗性吧?这个载体我还真这么做过,首先,平末端连接的比例,目的片段:载体=10:1吧,连接酶多加点,然后16度过夜吧,如果你是pcr产物连的话,切记载体不能去磷酸化,因为pcr片段没有磷酸集团,如果你是先连到克隆载体上再做的话,载体可以去磷酸化,还有涂抗性平板的时候,改造过的已经没有amp抗性了,别搞错了
3楼2012-12-29 15:26:50
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stardu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-29 11:03:52
目的片段的酶切位点是在末端吗?这个酶没人试过要加多少保护碱基,切割效率不好说啊。如果是PCR产物直接和载体连,需要磷酸化。对载体的酶切时间不要过长,电泳证明切开就可以了,不推荐切过夜。此外载体去磷酸化处 ...

目的片段的酶切位点是在抗性基因中间,不是在末端。不过我都是酶切过夜,然后回收的。因为是单酶切,载体我用pcr产物回收试剂盒回收的。不知道为什么,做了好几次,这个载体跑胶时有条带,胶回收后再跑胶就完全看不到条带了!
谢谢你哈!
5楼2012-12-29 15:46:18
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