| 查看: 2114 | 回复: 11 | ||
[求助]
请教一些原核表达的问题。
|
||
| 我现在在做一个基因的转录本检测，现在发现了几个转录本，都是连接到T载体克隆测序的，下一步想做原核表达，现在我用的是PET-28a载体，上面有Eco I 和 Hind III酶切位点，T载体上也有相应的酶切位点，请问我是不是可以直接双酶切T载体，然后连接到PET-28a载体上做原核表达？这种做法可行？需要注意一些上面问题呢？ |
回复此楼» 猜你喜欢
氢氧化钾活化操作
已经有19人回复
-
散金
已经有68人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有159人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
-
ALK5 高选择性小分子 LY-3200882：可放大合成路线与质控要点解析
已经有0人回复
-
AM630（CAS 164178-33-0）：CB2 选择性配体的实验使用与供应要点
已经有0人回复
-
ADC标杆分子T-DM1全解析：从结构设计到实验室应用的技术要点
已经有0人回复
-
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 原核表达分子量问题
已经有9人回复
- 原核表达做不出来了！
已经有15人回复
- 新手刚接触原核表达，蛋白Marker没有完全跑出来，请教一下高手，谢谢！
已经有12人回复
- 原核表达引物设计的问题
已经有6人回复
- 做原核表达引物设计的有关问题
已经有14人回复
- 原核表达载体的构建
已经有37人回复
- 原核表达蛋白变小
已经有4人回复
- 原核表达，蛋白活性问题
已经有12人回复
- 真核表达载体 原核 区别与扩增
已经有8人回复
- 原核表达形成了包涵体怎么办啊？
已经有22人回复
- 原核表达问题
已经有14人回复
- 原核表达蛋白诱导不出来
已经有16人回复
- 关于原核表达中，IPTG,KAN等的配制和最终工作浓度问题！！！
已经有16人回复
- 原核表达系统不表达目的蛋白
已经有8人回复
- 原核表达标签的切除，及信号肽的影响
已经有5人回复
- 原核同时表达两个蛋白，需要自行给其中一个加标签，请教了！！！
已经有4人回复
- 【求助/交流】请教原核表达菌株Rosetta gami（DE3）的生长时间
已经有4人回复
zhoulubin
银虫 (小有名气)
- 应助: 26 (小学生)
- 金币: 687.8
- 帖子: 122
- 在线: 70.9小时
- 虫号: 1215331
- 注册: 2011-02-27
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
8楼2013-08-05 10:57:13
zhoulubin
银虫 (小有名气)
- 应助: 26 (小学生)
- 金币: 687.8
- 帖子: 122
- 在线: 70.9小时
- 虫号: 1215331
- 注册: 2011-02-27
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnb1987(myprayer代发): 金币+2, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 08:13:33
cnb1987: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-06-19 17:03:30
感谢参与，应助指数 +1
cnb1987(myprayer代发): 金币+2, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 08:13:33
cnb1987: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-06-19 17:03:30
|
首先你这种想法理论上是可行的，但有很大风险 1.你不能保证目的片段连接到T vector上的方向，如果是反向连接，这样就肯定表达不出目的蛋白； 2.你不能保证从T载体上切下来再和pET28a连接后，读框没变。如果读框变了，也表达不出目的蛋白。 基于这两点，你这种方法成功的概率相当小。 还是自己在目的片段上添加上酶切位点吧，当然这个酶切位点可以和T Vector上的重复，这不影响。 |
2楼2013-06-18 16:15:42
lxj341401
至尊木虫 (著名写手)
- MolEPI: 58
- 应助: 388 (硕士)
- 贵宾: 0.238
- 金币: 17138.7
- 红花: 43
- 帖子: 2251
- 在线: 712.4小时
- 虫号: 111074
- 注册: 2005-11-20
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnb1987(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 08:13:42
cnb1987: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-06-19 17:02:44
感谢参与，应助指数 +1
cnb1987(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 08:13:42
cnb1987: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-06-19 17:02:44
|
不能这么做的，ORF会改变或者多出氨基酸。 设计带酶切位点、保护碱基的引物，以连接有目的基因的T载体为模板，用高保真的酶如Pfu进行扩增，PCR产物切胶回收后直接酶切，再连接pET28。 |
3楼2013-06-18 21:23:23
4楼2013-06-19 17:03:04
5楼2013-06-19 17:04:08
dcb005
金虫 (著名写手)
- 应助: 28 (小学生)
- 贵宾: 0.005
- 金币: 1108.8
- 散金: 110
- 红花: 2
- 帖子: 1850
- 在线: 103.1小时
- 虫号: 275937
- 注册: 2006-09-02
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
6楼2013-06-19 17:07:29
7楼2013-08-03 16:19:56
9楼2013-08-05 15:31:05
zhoulubin
银虫 (小有名气)
- 应助: 26 (小学生)
- 金币: 687.8
- 帖子: 122
- 在线: 70.9小时
- 虫号: 1215331
- 注册: 2011-02-27
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
10楼2013-08-05 16:43:07
10