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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教一些原核表达的问题。
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cnb1987

银虫 (小有名气)

[求助] 请教一些原核表达的问题。

我现在在做一个基因的转录本检测，现在发现了几个转录本，都是连接到T载体克隆测序的，下一步想做原核表达，现在我用的是PET-28a载体，上面有Eco I 和 Hind III酶切位点，T载体上也有相应的酶切位点，请问我是不是可以直接双酶切T载体，然后连接到PET-28a载体上做原核表达？这种做法可行？需要注意一些上面问题呢？
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1楼 2013-06-18 11:09:31
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cnb1987

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-08-05 10:57:13
“剪切体”是什么？
你把你目的片段酶切下来，连接到表达载体后，从表达载体的起始位点开始往下翻译，看这个氨基酸与目的蛋白的氨基酸序列是否一致。
不存在什么ORF，直接从表达载体的起始位点起始翻译，三个三个 ...

就是不同的转录本，我现在发现我扩增出来的目的片度，它的长度不是三的倍速。它也能翻译出蛋白么？
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9楼2013-08-05 15:31:05
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnb1987(myprayer代发): 金币+2, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 08:13:33
cnb1987: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-06-19 17:03:30
首先你这种想法理论上是可行的，但有很大风险
1.你不能保证目的片段连接到T vector上的方向，如果是反向连接，这样就肯定表达不出目的蛋白；
2.你不能保证从T载体上切下来再和pET28a连接后，读框没变。如果读框变了，也表达不出目的蛋白。
基于这两点，你这种方法成功的概率相当小。
还是自己在目的片段上添加上酶切位点吧，当然这个酶切位点可以和T Vector上的重复，这不影响。
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
2楼2013-06-18 16:15:42
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnb1987(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 08:13:42
cnb1987: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-06-19 17:02:44
不能这么做的，ORF会改变或者多出氨基酸。
设计带酶切位点、保护碱基的引物，以连接有目的基因的T载体为模板，用高保真的酶如Pfu进行扩增，PCR产物切胶回收后直接酶切，再连接pET28。
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3楼2013-06-18 21:23:23
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cnb1987

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-06-18 21:23:23
不能这么做的，ORF会改变或者多出氨基酸。
设计带酶切位点、保护碱基的引物，以连接有目的基因的T载体为模板，用高保真的酶如Pfu进行扩增，PCR产物切胶回收后直接酶切，再连接pET28。

嗯，我知道了，谢谢啊！
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4楼2013-06-19 17:03:04
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