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黎末18

木虫 (小有名气)

[求助] 新手刚接触原核表达,蛋白Marker没有完全跑出来,请教一下高手,谢谢!

我刚开始接触原核表达,这是第一次做,跑SDS-PAGE凝胶电泳的时候,做了3次,Marker都没有完全跑出来,Marker是生工的BM201 Protein Marker Low Range(4.1-66kDa),条带有9条,分别是66、45、35、27、20、14.4、9.5、6.5、4.1,我每次都只跑出来前4个条带,后面的就看不清了。5%的浓缩胶,15%的分离胶,配胶试剂都是生工的,1.5mm的板和梳子,11个孔的,加样20μl,电压先80,后120。
    我在网上看了看,有说到胶浓度的问题,Marker说明书上是15%,应该没错吧,新手还想不到更多的方面,所以想请教一下大家,请给个提示或建议,谢谢了!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
黎末18(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-10 13:01:13
有可能是marker的质量问题,也有可能是你的胶做的不好。marker是预变性过的还是你自己做的变性?你的目标蛋白多大分子量?样品中的蛋白条带是否上sharp?15%的SDS-PAGE上4.1的marker条带可能有些接近前沿,分辨率不是很高是正常的,其余的条带应该是没问题的。
2楼2013-05-10 11:38:15
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myfinalway

木虫 (正式写手)

用NEB或者MBI的蛋白Marker吧,质量没有问题
3楼2013-05-10 12:55:44
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黎末18

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-10 11:38:15
有可能是marker的质量问题,也有可能是你的胶做的不好。marker是预变性过的还是你自己做的变性?你的目标蛋白多大分子量?样品中的蛋白条带是否上sharp?15%的SDS-PAGE上4.1的marker条带可能有些接近前沿,分辨率不 ...

谢谢你的帮助!你说的很有可能,我再试试换一管Marker,继续做胶。Marker是预变性过的,我直接加的;目标蛋白是27.8和16.3kDa;不好意思,有点弱弱的问一下,你是说我样品中的蛋白条带是不是清晰的是吗?这种英文的不太懂,见笑了,条带跑的都不太好,师兄说太丑了,没有照片。还有,是不是说4.1的已经快跑出去了?今天还在继续做,晚上看看结果
4楼2013-05-10 14:43:58
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黎末18

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by myfinalway at 2013-05-10 12:55:44
用NEB或者MBI的蛋白Marker吧,质量没有问题

谢谢!下次换一下试试
5楼2013-05-10 14:47:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
黎末18(gyesang代发): 金币+1, 鼓励应助交流! 2013-05-11 12:04:06
引用回帖:
4楼: Originally posted by 黎末18 at 2013-05-10 14:43:58
谢谢你的帮助!你说的很有可能,我再试试换一管Marker,继续做胶。Marker是预变性过的,我直接加的;目标蛋白是27.8和16.3kDa;不好意思,有点弱弱的问一下,你是说我样品中的蛋白条带是不是清晰的是吗?这种英文的 ...

如果条带不清晰,可能是胶的问题。你检查一下配分离胶的tris缓冲液的pH是否正确。4.1也不是说会出去,就是离溴酚蓝比较近,胶的分辨率不是很好。
6楼2013-05-11 02:00:55
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黎末18

木虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-11 02:00:55
如果条带不清晰,可能是胶的问题。你检查一下配分离胶的tris缓冲液的pH是否正确。4.1也不是说会出去,就是离溴酚蓝比较近,胶的分辨率不是很好。...

谢谢您!分离胶的tris-hcl的ph是8.8,用的是现成的试剂,4×的,我加的时候按1×稀释用的,今天的脱色还没完全透明,但是marker还是只能看见前4条,打算买新的预染的marker试试。刚开始有很多都不懂,这是第一次上来问,谢谢您的应助!
7楼2013-05-11 10:48:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 黎末18 at 2013-05-11 10:48:39
谢谢您!分离胶的tris-hcl的ph是8.8,用的是现成的试剂,4×的,我加的时候按1×稀释用的,今天的脱色还没完全透明,但是marker还是只能看见前4条,打算买新的预染的marker试试。刚开始有很多都不懂,这是第一次上 ...

你把跑胶的图传上来看看吧。有些公司的marker质量不好,有些条带看不到也是有可能的。
8楼2013-05-11 11:36:47
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黎末18

木虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-11 11:36:47
你把跑胶的图传上来看看吧。有些公司的marker质量不好,有些条带看不到也是有可能的。...

跑的特别特别难看,marker跑的不好,目的条带也没出来,看不到,这是27.8的那个,见笑了

IMG_20130513_105116_旋转.jpg

9楼2013-05-13 14:14:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

你的胶可能有问题。确定缓冲液真的没有问题吗?灌胶后多长时间凝的?此外你跑的样品是全菌蛋白还是可溶蛋白?样品点样前是否离心?跑胶时溴酚蓝前沿是否整齐?
10楼2013-05-14 07:32:22
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