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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新手刚接触原核表达，蛋白Marker没有完全跑出来，请教一下高手，谢谢！
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黎末18

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-14 07:32:22
你的胶可能有问题。确定缓冲液真的没有问题吗？灌胶后多长时间凝的？此外你跑的样品是全菌蛋白还是可溶蛋白？样品点样前是否离心？跑胶时溴酚蓝前沿是否整齐？

现在有点怀疑买的现成的试剂说不上也不好，下次自己配一下，看是不是真的溶液有问题。灌胶后我怕凝不好，都凝了一个小时，但是我发现小烧杯里面就算凝一个小时也有少量水分没有完全凝，感觉就像胶凝了，但沥出来了水一样，不知道你能懂我说的不？我跑的是全菌蛋白，这个图点样前没有离心，上次样品很粘稠吸不出来，离心之后加上也是这样的，有时候加样很不好加；跑胶的时候有一次是整齐的，这次的有点斜了。好多问题，麻烦您了，我真是太弱了，谢谢啦！
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11楼2013-05-14 19:49:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
黎末18: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-05-16 09:01:44
引用回帖:
11楼: Originally posted by 黎末18 at 2013-05-14 19:49:44
现在有点怀疑买的现成的试剂说不上也不好，下次自己配一下，看是不是真的溶液有问题。灌胶后我怕凝不好，都凝了一个小时，但是我发现小烧杯里面就算凝一个小时也有少量水分没有完全凝，感觉就像胶凝了，但沥出来了 ...

你只要用pH计检查一下买的试剂的pH。配胶缓冲液的pH还是很重要的。
关于凝胶的问题，你灌好分离胶水封胶面后可以看到很清楚的水层和胶层分界面。过一阵子这个界面会变模糊，这时正在凝胶，不要移动胶。一般凝30分钟到一个小时后，你应该看到模糊的界面逐渐变成非常清晰的一条水层和胶层分界线，这样就是表明胶凝好了。烧杯里残留的溶液比较少，与空气接触面大，胶凝的速度往往比灌在板间的胶慢。而且凝胶的反应会产生少量水，大概就是你说的有少量水分没有完全凝。
如果你的样品粘糊糊的，说明是样品浓度太大。因为做全菌蛋白一般就是直接用上样buffer破碎菌，没有超声步骤，样品中含有大量核酸，会使样品粘度很高。你在处理样品的时候对同样的菌体增加上样buffer的体积。而且点样前最好离心样品，以免有不溶物堵塞胶孔。
蛋白胶多跑跑经验多了就会好看的。
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12楼2013-05-15 07:24:32
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黎末18

木虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-15 07:24:32
你只要用pH计检查一下买的试剂的pH。配胶缓冲液的pH还是很重要的。
关于凝胶的问题，你灌好分离胶水封胶面后可以看到很清楚的水层和胶层分界面。过一阵子这个界面会变模糊，这时正在凝胶，不要移动胶。一般凝30分 ...

嗯，好的，知道了，谢谢您！您解释的真是详尽，真心谢谢您的帮助~
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13楼2013-05-16 08:58:02
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