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黎末18

木虫 (小有名气)

[求助] 新手刚接触原核表达,蛋白Marker没有完全跑出来,请教一下高手,谢谢!

我刚开始接触原核表达,这是第一次做,跑SDS-PAGE凝胶电泳的时候,做了3次,Marker都没有完全跑出来,Marker是生工的BM201 Protein Marker Low Range(4.1-66kDa),条带有9条,分别是66、45、35、27、20、14.4、9.5、6.5、4.1,我每次都只跑出来前4个条带,后面的就看不清了。5%的浓缩胶,15%的分离胶,配胶试剂都是生工的,1.5mm的板和梳子,11个孔的,加样20μl,电压先80,后120。
    我在网上看了看,有说到胶浓度的问题,Marker说明书上是15%,应该没错吧,新手还想不到更多的方面,所以想请教一下大家,请给个提示或建议,谢谢了!
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黎末18

木虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-14 07:32:22
你的胶可能有问题。确定缓冲液真的没有问题吗?灌胶后多长时间凝的?此外你跑的样品是全菌蛋白还是可溶蛋白?样品点样前是否离心?跑胶时溴酚蓝前沿是否整齐?

现在有点怀疑买的现成的试剂说不上也不好,下次自己配一下,看是不是真的溶液有问题。灌胶后我怕凝不好,都凝了一个小时,但是我发现小烧杯里面就算凝一个小时也有少量水分没有完全凝,感觉就像胶凝了,但沥出来了水一样,不知道你能懂我说的不?我跑的是全菌蛋白,这个图点样前没有离心,上次样品很粘稠吸不出来,离心之后加上也是这样的,有时候加样很不好加;跑胶的时候有一次是整齐的,这次的有点斜了。好多问题,麻烦您了,我真是太弱了,谢谢啦!
11楼2013-05-14 19:49:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
黎末18(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-10 13:01:13
有可能是marker的质量问题,也有可能是你的胶做的不好。marker是预变性过的还是你自己做的变性?你的目标蛋白多大分子量?样品中的蛋白条带是否上sharp?15%的SDS-PAGE上4.1的marker条带可能有些接近前沿,分辨率不是很高是正常的,其余的条带应该是没问题的。
2楼2013-05-10 11:38:15
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myfinalway

木虫 (正式写手)

用NEB或者MBI的蛋白Marker吧,质量没有问题
3楼2013-05-10 12:55:44
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黎末18

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-10 11:38:15
有可能是marker的质量问题,也有可能是你的胶做的不好。marker是预变性过的还是你自己做的变性?你的目标蛋白多大分子量?样品中的蛋白条带是否上sharp?15%的SDS-PAGE上4.1的marker条带可能有些接近前沿,分辨率不 ...

谢谢你的帮助!你说的很有可能,我再试试换一管Marker,继续做胶。Marker是预变性过的,我直接加的;目标蛋白是27.8和16.3kDa;不好意思,有点弱弱的问一下,你是说我样品中的蛋白条带是不是清晰的是吗?这种英文的不太懂,见笑了,条带跑的都不太好,师兄说太丑了,没有照片。还有,是不是说4.1的已经快跑出去了?今天还在继续做,晚上看看结果
4楼2013-05-10 14:43:58
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