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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新手刚接触原核表达，蛋白Marker没有完全跑出来，请教一下高手，谢谢！
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黎末18

木虫 (小有名气)

[求助] 新手刚接触原核表达，蛋白Marker没有完全跑出来，请教一下高手，谢谢！

我刚开始接触原核表达，这是第一次做，跑SDS-PAGE凝胶电泳的时候，做了3次，Marker都没有完全跑出来，Marker是生工的BM201 Protein Marker Low Range(4.1-66kDa)，条带有9条，分别是66、45、35、27、20、14.4、9.5、6.5、4.1，我每次都只跑出来前4个条带，后面的就看不清了。5%的浓缩胶，15%的分离胶，配胶试剂都是生工的，1.5mm的板和梳子，11个孔的，加样20μl，电压先80，后120。
    我在网上看了看，有说到胶浓度的问题，Marker说明书上是15%，应该没错吧，新手还想不到更多的方面，所以想请教一下大家，请给个提示或建议，谢谢了！
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1楼2013-05-10 11:05:53
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黎末18

木虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-10 11:38:15
有可能是marker的质量问题，也有可能是你的胶做的不好。marker是预变性过的还是你自己做的变性？你的目标蛋白多大分子量？样品中的蛋白条带是否上sharp？15%的SDS-PAGE上4.1的marker条带可能有些接近前沿，分辨率不 ...

谢谢你的帮助！你说的很有可能，我再试试换一管Marker，继续做胶。Marker是预变性过的，我直接加的；目标蛋白是27.8和16.3kDa；不好意思，有点弱弱的问一下，你是说我样品中的蛋白条带是不是清晰的是吗？这种英文的不太懂，见笑了，条带跑的都不太好，师兄说太丑了，没有照片。还有，是不是说4.1的已经快跑出去了？今天还在继续做，晚上看看结果
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4楼2013-05-10 14:43:58
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黎末18

木虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by myfinalway at 2013-05-10 12:55:44
用NEB或者MBI的蛋白Marker吧，质量没有问题

谢谢！下次换一下试试
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5楼2013-05-10 14:47:20
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黎末18

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-11 02:00:55
如果条带不清晰，可能是胶的问题。你检查一下配分离胶的tris缓冲液的pH是否正确。4.1也不是说会出去，就是离溴酚蓝比较近，胶的分辨率不是很好。...

谢谢您！分离胶的tris-hcl的ph是8.8，用的是现成的试剂，4×的，我加的时候按1×稀释用的，今天的脱色还没完全透明，但是marker还是只能看见前4条，打算买新的预染的marker试试。刚开始有很多都不懂，这是第一次上来问，谢谢您的应助！
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7楼2013-05-11 10:48:39
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黎末18

木虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-11 11:36:47
你把跑胶的图传上来看看吧。有些公司的marker质量不好，有些条带看不到也是有可能的。...

跑的特别特别难看，marker跑的不好，目的条带也没出来，看不到，这是27.8的那个，见笑了

IMG_20130513_105116_旋转.jpg
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9楼2013-05-13 14:14:13
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黎末18

木虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-14 07:32:22
你的胶可能有问题。确定缓冲液真的没有问题吗？灌胶后多长时间凝的？此外你跑的样品是全菌蛋白还是可溶蛋白？样品点样前是否离心？跑胶时溴酚蓝前沿是否整齐？

现在有点怀疑买的现成的试剂说不上也不好，下次自己配一下，看是不是真的溶液有问题。灌胶后我怕凝不好，都凝了一个小时，但是我发现小烧杯里面就算凝一个小时也有少量水分没有完全凝，感觉就像胶凝了，但沥出来了水一样，不知道你能懂我说的不？我跑的是全菌蛋白，这个图点样前没有离心，上次样品很粘稠吸不出来，离心之后加上也是这样的，有时候加样很不好加；跑胶的时候有一次是整齐的，这次的有点斜了。好多问题，麻烦您了，我真是太弱了，谢谢啦！
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11楼2013-05-14 19:49:44
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黎末18

木虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-15 07:24:32
你只要用pH计检查一下买的试剂的pH。配胶缓冲液的pH还是很重要的。
关于凝胶的问题，你灌好分离胶水封胶面后可以看到很清楚的水层和胶层分界面。过一阵子这个界面会变模糊，这时正在凝胶，不要移动胶。一般凝30分 ...

嗯，好的，知道了，谢谢您！您解释的真是详尽，真心谢谢您的帮助~
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13楼2013-05-16 08:58:02
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