24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 2224  |  回复: 12
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

黎末18

木虫 (小有名气)

[求助] 新手刚接触原核表达,蛋白Marker没有完全跑出来,请教一下高手,谢谢!

我刚开始接触原核表达,这是第一次做,跑SDS-PAGE凝胶电泳的时候,做了3次,Marker都没有完全跑出来,Marker是生工的BM201 Protein Marker Low Range(4.1-66kDa),条带有9条,分别是66、45、35、27、20、14.4、9.5、6.5、4.1,我每次都只跑出来前4个条带,后面的就看不清了。5%的浓缩胶,15%的分离胶,配胶试剂都是生工的,1.5mm的板和梳子,11个孔的,加样20μl,电压先80,后120。
    我在网上看了看,有说到胶浓度的问题,Marker说明书上是15%,应该没错吧,新手还想不到更多的方面,所以想请教一下大家,请给个提示或建议,谢谢了!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

黎末18

木虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-15 07:24:32
你只要用pH计检查一下买的试剂的pH。配胶缓冲液的pH还是很重要的。
关于凝胶的问题,你灌好分离胶水封胶面后可以看到很清楚的水层和胶层分界面。过一阵子这个界面会变模糊,这时正在凝胶,不要移动胶。一般凝30分 ...

嗯,好的,知道了,谢谢您!您解释的真是详尽,真心谢谢您的帮助~
13楼2013-05-16 08:58:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
黎末18(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-10 13:01:13
有可能是marker的质量问题,也有可能是你的胶做的不好。marker是预变性过的还是你自己做的变性?你的目标蛋白多大分子量?样品中的蛋白条带是否上sharp?15%的SDS-PAGE上4.1的marker条带可能有些接近前沿,分辨率不是很高是正常的,其余的条带应该是没问题的。
2楼2013-05-10 11:38:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

myfinalway

木虫 (正式写手)

用NEB或者MBI的蛋白Marker吧,质量没有问题
3楼2013-05-10 12:55:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

黎末18

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-10 11:38:15
有可能是marker的质量问题,也有可能是你的胶做的不好。marker是预变性过的还是你自己做的变性?你的目标蛋白多大分子量?样品中的蛋白条带是否上sharp?15%的SDS-PAGE上4.1的marker条带可能有些接近前沿,分辨率不 ...

谢谢你的帮助!你说的很有可能,我再试试换一管Marker,继续做胶。Marker是预变性过的,我直接加的;目标蛋白是27.8和16.3kDa;不好意思,有点弱弱的问一下,你是说我样品中的蛋白条带是不是清晰的是吗?这种英文的不太懂,见笑了,条带跑的都不太好,师兄说太丑了,没有照片。还有,是不是说4.1的已经快跑出去了?今天还在继续做,晚上看看结果
4楼2013-05-10 14:43:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
信息提示
请填处理意见