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yangjingjing

木虫 (正式写手)

[求助] 原核表达分子量问题

好容易构建了质粒(组氨酸标签),测序正确,而且分析表达蛋白分子量应该在27KD,可是跑SDS时在25KD,35KD都有表达,纯化完后在35KD处有明显的单条带,为什么呢?测序结果如下,求各位大神帮忙分析下~~跪谢
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你用的什么表达载体?除了his-tag外还带不带其它标签?
2楼2013-06-09 00:37:54
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-09 09:20:18
大一点还是有可能的,很多文献,也出现过这种情况,他们的解释是由于标签的加入
你最好说明你的载体,片段大小,page图片
不然这样也没法看
3楼2013-06-09 01:50:06
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yangjingjing(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-06-10 16:58:29
大一点是有可能的,我曾经做过一个蛋白,计算分子量28KD,PAGE胶分子量35KD。质谱显示是正确的。不过你还是确认一下你的终止密码子是在哪儿终止的,没问题的话这样也是有可能的。
4楼2013-06-09 16:54:20
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-09 00:37:54
你用的什么表达载体?除了his-tag外还带不带其它标签?

PET-22,不带了~而且纯化完SDS35的位置有个条带,可转膜后和我目的基因的抗体却没有作用,那就是说还是木有表达了?可以麻烦帮忙分析下是什么原因吗?
努力打败一切
5楼2013-06-09 23:52:23
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaoweiwei121 at 2013-06-09 01:50:06
大一点还是有可能的,很多文献,也出现过这种情况,他们的解释是由于标签的加入
你最好说明你的载体,片段大小,page图片
不然这样也没法看

呵呵,不好意思,太业余了~载体是PET-22,目的基因本来是594。不同剂量诱导25,35位置都有明显增加,纯化后SDS 35位置有单一条带,但是转膜后敷相应抗体后却几乎没有条带,是不是木有表达啊?
努力打败一切
6楼2013-06-09 23:55:23
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-06-09 16:54:20
大一点是有可能的,我曾经做过一个蛋白,计算分子量28KD,PAGE胶分子量35KD。质谱显示是正确的。不过你还是确认一下你的终止密码子是在哪儿终止的,没问题的话这样也是有可能的。

恩,就是软件分析的,是在组氨酸之后就终止了。可是为什么IPTG诱导完25,35位置有增加,纯化完SDS  只有35位置,转膜却不和目的抗体结合呢?是说明没有表达吗?
努力打败一切
7楼2013-06-09 23:57:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-06-09 23:52:23
PET-22,不带了~而且纯化完SDS35的位置有个条带,可转膜后和我目的基因的抗体却没有作用,那就是说还是木有表达了?可以麻烦帮忙分析下是什么原因吗?...

未纯化的样品用目的蛋白的抗体是否有带?如果有的话,可能是纯化的问题。如果没有,你可以试试his抗体。
8楼2013-06-10 01:16:49
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-10 01:16:49
未纯化的样品用目的蛋白的抗体是否有带?如果有的话,可能是纯化的问题。如果没有,你可以试试his抗体。...

未纯化的蛋白浓度太低了,不能转膜敷抗体吧?
努力打败一切
9楼2013-06-10 11:22:47
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-06-10 11:22:47
未纯化的蛋白浓度太低了,不能转膜敷抗体吧?...

不会,western的灵敏度比较高,ng级别的蛋白就足以检测到。
10楼2013-06-11 05:55:25
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