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请教一些原核表达的问题。
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| 我现在在做一个基因的转录本检测，现在发现了几个转录本，都是连接到T载体克隆测序的，下一步想做原核表达，现在我用的是PET-28a载体，上面有Eco I 和 Hind III酶切位点，T载体上也有相应的酶切位点，请问我是不是可以直接双酶切T载体，然后连接到PET-28a载体上做原核表达？这种做法可行？需要注意一些上面问题呢？ |
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5楼2013-06-19 17:04:08
zhoulubin
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首先你这种想法理论上是可行的，但有很大风险 1.你不能保证目的片段连接到T vector上的方向，如果是反向连接，这样就肯定表达不出目的蛋白； 2.你不能保证从T载体上切下来再和pET28a连接后，读框没变。如果读框变了，也表达不出目的蛋白。 基于这两点，你这种方法成功的概率相当小。 还是自己在目的片段上添加上酶切位点吧，当然这个酶切位点可以和T Vector上的重复，这不影响。 |
2楼2013-06-18 16:15:42
lxj341401
至尊木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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不能这么做的，ORF会改变或者多出氨基酸。 设计带酶切位点、保护碱基的引物，以连接有目的基因的T载体为模板，用高保真的酶如Pfu进行扩增，PCR产物切胶回收后直接酶切，再连接pET28。 |
3楼2013-06-18 21:23:23
4楼2013-06-19 17:03:04
