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载体酶切位点与目的片段重复
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| 第一次做分子实验，选择了PMD-19T载体，连接目的片段后，再亚克隆到PET-28a上，现在遇到了个问题，就是当时在设计引物加酶切位点时，只考虑到了PET-28a和目的片段，设计出的酶切位点在PMD-19T上都有，怎么吧啊，可以用吗，加的位点是HindⅢ和EcoRⅠ。。。。大家帮帮忙吧。。。 |
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kehuang611
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4楼2013-06-25 12:56:09
【答案】应助回帖
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zhangxingc: 金币+3, 鼓励新虫应助，欢迎常到微生物版 2013-06-25 11:41:38
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和我用的酶切位点是一样的，我用了pEt28a+ PMD-19T载体应该只是一个保留这个目的片段的把？用PCR扩增，设计引物，这时候引物就该注意点了，引物就包括ECORI 和HindIII酶切位点最好再弄点你们的目标基因的片段，要不然估计会把PMD-19T的基因给扩增出来，这样子就只扩增含有酶切位点的目标基因了，然后琼脂糖电泳一下看看有没有扩增出来目标基因。 随后目标基因和pEt28a+同时进行双酶切，DNA连接酶16℃连接过夜，然后再做一个琼脂糖电泳，一个是连接之后的，还有一个是没有连接的目标基因和pet28a都进行酶切之后的混合液，跑完电泳看看有没有顺利连接就好了。 |
2楼2013-06-25 11:34:00
3楼2013-06-25 12:36:06
kehuang611
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zhangxingc: 金币+3, 鼓励新虫积极应助 2013-06-25 13:29:04
zhangxingc: 金币+3, 鼓励新虫积极应助 2013-06-25 13:29:04
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在目的片段与PMD-19T连接后，实验预计是用上面两个酶将目的片段切下来，然后电泳，切胶回收目的片段，然后连接PET-28a，但是比如载体ECORI到目的片段ECORI距离是A，目的片段长是B，目的片段hindIII到载体hindIII的距离是C，双酶切后得到的片段长度可能是A+B,A+B+C,B+C,A,B,C。这可怎么办，需要重新设计一条只在pet-28a上有的酶切位点的引物吗？ 还有这种说法就有问题，楼主应该明白酶切的话只要在酶量做够时，只要有酶切位点就会切开，所以酶切后剩下的只会是带两段酶切末端的你的片段。 |
5楼2013-06-25 12:59:20
