| 查看: 2141 | 回复: 13 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
载体酶切位点与目的片段重复
|
||
| 第一次做分子实验，选择了PMD-19T载体，连接目的片段后，再亚克隆到PET-28a上，现在遇到了个问题，就是当时在设计引物加酶切位点时，只考虑到了PET-28a和目的片段，设计出的酶切位点在PMD-19T上都有，怎么吧啊，可以用吗，加的位点是HindⅢ和EcoRⅠ。。。。大家帮帮忙吧。。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
心脉受损
已经有5人回复
-
博士读完未来一定会好吗
已经有15人回复
-
Springer期刊投稿求助
已经有4人回复
-
读博
已经有3人回复
-
小论文投稿
已经有3人回复
-
Bioresource Technology期刊，第一次返修的时候被退回好几次了
已经有9人回复
-
到新单位后，换了新的研究方向，没有团队，持续积累2区以上论文，能申请到面上吗
已经有8人回复
-
申请2026年博士
已经有6人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
请教一些原核表达的问题。
已经有11人回复- 构建表达载体PBI121阳性对照
已经有5人回复
- 目的基因构建载体方向问题概念有点不清楚，请教各位大侠
已经有5人回复
- 有没有用过XmnI这个酶的?酶切后连接需要注意什么问题么？
已经有12人回复
- PGAPZA载体的使用
已经有6人回复
- 双酶切后目的片段变大
已经有11人回复
- 目的片段中含有酶切位点，求解决方案
已经有3人回复
- pET28a载体和目的基因
已经有9人回复
- 双酶切后载体片段变小
已经有8人回复
- 双酶切，切不下来
已经有19人回复
- T载体酶切片段与目的片段大小不一致
已经有12人回复
- 请问用Vector NTI如何实现在pET28a中加入目的基因片段的谱图绘制。
已经有10人回复
- 做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???
已经有24人回复
- 载体连接
已经有7人回复
- 【求助/交流】TA克隆
已经有15人回复
kehuang611
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: -1.4
- 散金: 8
- 帖子: 83
- 在线: 39.8小时
- 虫号: 2427552
- 注册: 2013-04-20
- 性别: GG
- 专业: 微生物生态学
4楼2013-06-25 12:56:09
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxingc: 金币+3, 鼓励新虫应助，欢迎常到微生物版 2013-06-25 11:41:38
感谢参与，应助指数 +1
zhangxingc: 金币+3, 鼓励新虫应助，欢迎常到微生物版 2013-06-25 11:41:38
|
和我用的酶切位点是一样的，我用了pEt28a+ PMD-19T载体应该只是一个保留这个目的片段的把？用PCR扩增，设计引物，这时候引物就该注意点了，引物就包括ECORI 和HindIII酶切位点最好再弄点你们的目标基因的片段，要不然估计会把PMD-19T的基因给扩增出来，这样子就只扩增含有酶切位点的目标基因了，然后琼脂糖电泳一下看看有没有扩增出来目标基因。 随后目标基因和pEt28a+同时进行双酶切，DNA连接酶16℃连接过夜，然后再做一个琼脂糖电泳，一个是连接之后的，还有一个是没有连接的目标基因和pet28a都进行酶切之后的混合液，跑完电泳看看有没有顺利连接就好了。 |
2楼2013-06-25 11:34:00
3楼2013-06-25 12:36:06
kehuang611
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: -1.4
- 散金: 8
- 帖子: 83
- 在线: 39.8小时
- 虫号: 2427552
- 注册: 2013-04-20
- 性别: GG
- 专业: 微生物生态学
★ ★ ★
zhangxingc: 金币+3, 鼓励新虫积极应助 2013-06-25 13:29:04
zhangxingc: 金币+3, 鼓励新虫积极应助 2013-06-25 13:29:04
|
在目的片段与PMD-19T连接后，实验预计是用上面两个酶将目的片段切下来，然后电泳，切胶回收目的片段，然后连接PET-28a，但是比如载体ECORI到目的片段ECORI距离是A，目的片段长是B，目的片段hindIII到载体hindIII的距离是C，双酶切后得到的片段长度可能是A+B,A+B+C,B+C,A,B,C。这可怎么办，需要重新设计一条只在pet-28a上有的酶切位点的引物吗？ 还有这种说法就有问题，楼主应该明白酶切的话只要在酶量做够时，只要有酶切位点就会切开，所以酶切后剩下的只会是带两段酶切末端的你的片段。 |
5楼2013-06-25 12:59:20