| 查看: 5519 | 回复: 8 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
双酶切后载体片段变小
|
|||
|
本人实验中遇到点问题，现将详细过程书写如下，并附带详细的参考信息。 目的基因长度：900bp 目的基因的前端有NdeI酶切位点，后端有BamHI酶切位点。目的基因是由公司合成好以后构建到pGEM-T载体上，转化到DH5α中。 pET3a（大小4640bp） pET20b（大小3716bp） 以及pGEM-T（大小3000bp）都是转化到DH5α中，提取质粒以后做双酶切的时候都载体的大小正确（如图1），可以排除同源重组的可能性。  图1 （图1）提取质粒后做双酶切，从图中可以看到pET3a和pT-taget质粒都已经完全切开，且载体与目的基因的大小都正确。注：pT-taget双酶切以后载体有两条带，这是因为目的基因和T载体上都带有NdeI酶切位点，目的基因的末端A与T载体的T相连时存在正反向相连两种情况，目的基因大小为900bp左右，所以在没有完全切开质粒的时候载体会与两种情况，大小相差900bp左右。  图2 （图2）目的基因双酶切后分别与pET3a和pET20b相连接，转化DH5α细胞，挑取单克隆提质粒双酶切后的电泳结果。图中用DH5α中提取的pET3a和pET20b质粒做的双酶切作为载体的对照；连接后双酶切目的基因的条带大小正确，但载体的大小发生改变，都比原先载体片段小。 我的问题就是，为什么连接了以后原先的载体会变小（已经重复了多次实验，更换了感受态细胞，重新提质粒，重新酶切的载体等等）。  图3 （图3）pET3a-target与pET20b-target分别用NdeI和BamHI做单酶切；3a加目的基因条带应该在5000左右，处于Marker10000中从上数第三条带4000以上，然而切出来的条带位于4000一下；同样，20b载体单酶切后加上目的条带也应在4000以上。 总的来说，目的基因连入载体以后，载体序列酶切后发生的构象的改变，导致条带位置发生改变，请问这具体的原因是什么呢？  pGEM-T  pET-3a  pET-20b [ Last edited by shoppinggirl on 2012-8-18 at 19:13 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有263人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- PBI121载体与目的片段连接后双酶切问题
已经有23人回复
- 片段连接到载体后，总在酶切位点处发生缺失
已经有5人回复
- 双酶切后如何才能让载体自连？
已经有6人回复
- T载体上的酶切位点
已经有4人回复
- 请教关于载体中酶切位点和插入片段的问题
已经有12人回复
- 单酶切后的载体和目的片段是否都需要去磷酸化
已经有4人回复
- pMD19-T双酶切，目的片段上酶切位点和载体上一样
已经有7人回复
- pMD18-T载体连接了目的片段后双酶切鉴定出现了好多条带 怎么回事?
已经有6人回复
- 酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？
已经有14人回复
- 载体酶切位点与目的片段重复
已经有13人回复
- 关于双酶切作用时间
已经有10人回复
- t载体酶切问题
已经有15人回复
- pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
已经有23人回复
- pMD18-T载体不需要酶切吗
已经有10人回复
- 双酶切后目的条带很淡，回收不到
已经有15人回复
- 质粒提取 酶切 T载体与目的基因
已经有5人回复
- PET-30a 双酶切
已经有4人回复
- 载体和酶切片段连接的问题
已经有5人回复
- T载体酶切片段与目的片段大小不一致
已经有12人回复
- 【求助/交流】片段转进去，提质粒酶切发现载体小了，想不明白
已经有19人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
南京都市圈高校大龄离异博士征友
+2/552
-
【CSC招生】拉瓦尔大学流体力学博士项目
+3/186
-
Analytical Science Advances 征稿中
+1/175
-
有南京的小伙伴吗，蹲个男朋友
+1/79
-
坐标上海，93年诚征女友
+1/77
-
浙江师范大学申利国教授招聘博士后研究人员
+1/57
-
有没有在ITO或者FTO玻璃上做好的CdS薄膜购买？
+1/31
-
中南民族大学超支化聚合物团队2026年博士研究生招生
+1/30
-
北京理工大学计算材料化学课题组招聘2026年博士生/博后
+3/24
-
口腔健康的标准
+1/12
-
经济学博士（金融方向）招生，211重点大学，2026年9月入学，申请-考核制。
+1/9
-
天津大学化学系吴立朋课题组申请考核制博士招生/博后招聘
+1/8
-
中国科学院大连化学物理研究所DNL0902研究组招聘博士后和职工
+1/8
-
澳科大药学院诚招2026年秋季药剂学/生物材料博士研究生
+1/7
-
海南大学！海洋与极地地质团队长期招收博士和博士后
+1/6
-
浙江大学杨林课题组招聘药物化学与有机合成方向博士后
+1/3
-
中科院苏州医工所单细胞分析技术中心招聘公告（细胞分选、图像识别、流式应用方向）
+1/3
-
北京科技大学现代农学院智慧农业系博士研究生招生启事
+1/3
-
诚招“先进材料与柔性电子（柔性储能或柔性天线）”方向联培博士生
+1/2
-
下一代半导体激光器概念验证中心（筹）招聘工程师
+1/1
6楼2012-08-20 12:52:00
2楼2012-08-19 13:59:08
3楼2012-08-19 19:05:07
4楼2012-08-20 00:20:55