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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 请教关于载体中酶切位点和插入片段的问题
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我是传奇456

金虫 (正式写手)

[求助] 请教关于载体中酶切位点和插入片段的问题 已有3人参与

往某载体中插入基因片段，我想请问：
1.两个酶切位点之间相隔10bp,我的插入片段有800左右，这样效率高吗？
2.是否片段大的话，就需要用相隔碱基数较大的两个酶切位点呢？

拜谢！
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1楼 2014-02-14 16:37:11
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回帖置顶 ( 共有1个 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我是传奇456: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 感谢回答。 2014-02-15 14:32:22
gyesang: 回帖置顶 2014-02-15 16:54:44
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-15 16:54:49
1. 切割效率与使用的限制性内切酶有关。通常情况下，10bp间隔是没有问题的。
2. 酶切效率与插入片段大小无关，片段过大会降低连接转化效率。
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4楼2014-02-15 12:24:10
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-14 16:58:17
我是传奇456: 金币+3, ★★★很有帮助, 感谢回答。 2014-02-15 14:32:52
只要酶切处理完全，连接效率会很高。10bp大小足够酶识别酶切位点。
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hehe
2楼2014-02-14 16:48:51
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2014神虫浮云

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我是传奇456: 金币+2, ★有帮助, 多谢回答。 2014-02-15 14:32:40
不行，两个酶切位点距离太近，质粒无法完成双酶切，连接很难成功
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ffgtfvtyju7hjhv
3楼2014-02-14 17:29:17
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普通回帖

我是传奇456

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-02-15 12:24:10
1. 切割效率与使用的限制性内切酶有关。通常情况下，10bp间隔是没有问题的。
2. 酶切效率与插入片段大小无关，片段过大会降低连接转化效率。

我还想请教一个问题：

像18-T这种进行TA克隆的载体，当我PCR产物自带酶切位点（T载体上带有此位点），与T载体链接后，产物所在的位置是在此酶切位点上，还是在T载体上设计的TA克隆位点？

盼答复！
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5楼2014-02-15 14:50:41
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acvhreinlg

银虫 (正式写手)
如果可以两个酶切位点这么近，为何一定要选这两个呢，当然可以试试看么

[ 发自小木虫客户端 ]
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科研是将金钱转换为知识的过程，而创新则是将知识转换为金钱的过程。
6楼2014-02-15 15:08:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 我是传奇456 at 2014-02-15 14:50:41
我还想请教一个问题：

像18-T这种进行TA克隆的载体，当我PCR产物自带酶切位点（T载体上带有此位点），与T载体链接后，产物所在的位置是在此酶切位点上，还是在T载体上设计的TA克隆位点？

盼答复！...

产物是插在TA克隆位点处，如果插入片段带有T载体相同的酶切位点，克隆后的重组质粒上会带有两个相同的酶切位点，因为TA克隆可能有两个方向，两个酶切位点可以是在克隆基因的两端，或者是在同一侧。
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7楼2014-02-16 12:45:59
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-02-16 12:45:59
产物是插在TA克隆位点处，如果插入片段带有T载体相同的酶切位点，克隆后的重组质粒上会带有两个相同的酶切位点，因为TA克隆可能有两个方向，两个酶切位点可以是在克隆基因的两端，或者是在同一侧。...

说的我有点糊涂了。。。
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
8楼2014-02-16 13:44:04
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
1、片段大的话可以延长连接的时间
2、问过实验室的其他同学了，不用
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
9楼2014-02-16 13:46:28
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 我是传奇456 at 2014-02-15 14:50:41
我还想请教一个问题：

像18-T这种进行TA克隆的载体，当我PCR产物自带酶切位点（T载体上带有此位点），与T载体链接后，产物所在的位置是在此酶切位点上，还是在T载体上设计的TA克隆位点？

盼答复！...

首先设计的一对引物各带有一个酶切位点，经过PCR扩增后，扩增产物包括目的基因以及酶切位点序列。与T载体连接后，连接的是你的扩增产物，当你进行双酶切时，正好从克隆进T载体的酶切位点进行酶切。如果还有不懂的话再给你画图
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
10楼2014-02-16 14:00:03
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