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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因插入突变的一点疑惑？
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zhaoyu2881

木虫 (正式写手)

[求助] 基因插入突变的一点疑惑？

第一次着手做插入突变，打算将目的基因（~1kb）插入到质粒pBS的MCS中，然后插入抗性基因使其失活。现在有个疑惑，所要插入的目的基因需要是全长吗，还是基因的一部分也可以？现用实验室现有的引物扩增出大概850-900bp的片段，我不知道是否需要重新设计引物扩出全长，然后再做插入突变？

第一次做insertion mutant，不是很懂，希望有经验的虫虫们不吝指教~~谢谢！
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Thatislife,onlylifehurts.
1楼 2012-09-28 02:18:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+2, ★有帮助, 谢谢你，我是通过酶切后插入抗性基因使目的基因失活的方法，如果是这种情况呢？ 2012-09-28 10:07:50
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-28 14:50:48
如果你是通过同源重组使目的基因失活的话，应该在抗性基因的两端分别是你的目的基因的上游片段和目的基因的下游片段，这两边的片段大小最好差不多，一般不需要全长，足够发生重组就行了。所需片段的大小和物种有关。你可以查一下文献。
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2楼2012-09-28 06:35:15
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+1, 谢谢，那怎么知道是不是在翻译区呢？ 2012-09-28 11:26:58
我觉得你只要插入翻译区就可以吧！
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持之以恒、永不放弃！
3楼2012-09-28 09:53:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-28 14:50:59
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-28 06:35:15
如果你是通过同源重组使目的基因失活的话，应该在抗性基因的两端分别是你的目的基因的上游片段和目的基因的下游片段，这两边的片段大小最好差不多，一般不需要全长，足够发生重组就行了。所需片段的大小和物种有关。 ...

你是说你要失活的基因里面正好有一个酶切位点，可以用于插入抗性基因？这样的话就简单了，你直接PCR出一段你的目的基因，让那个酶切位点在中间，克隆到任何克隆载体的CMS，然后插入抗性基因。如果你是做失活，而且P的仅仅是在目的基因内部的话，都不用测序了，直接用克隆好的质粒转化宿主。
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4楼2012-09-28 14:16:28
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zhaoyu2881

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-28 14:16:28
你是说你要失活的基因里面正好有一个酶切位点，可以用于插入抗性基因？这样的话就简单了，你直接PCR出一段你的目的基因，让那个酶切位点在中间，克隆到任何克隆载体的CMS，然后插入抗性基因。如果你是做失活，而且 ...

恩，是呢，是打算像你说的这样做呢。我只是现在担心，如果P出来的基因不是全长，会不会在抗性基因插入失活之前，我的目的片段就已经不是功能基因了，那到最后转化到宿主后，岂不是不能说明是因为插入而引起的失活了？
刚起步做分子，不是很懂，多多指教了~~
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Thatislife,onlylifehurts.
5楼2012-09-28 22:18:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
zhaoyu2881: 金币+6, ★★★很有帮助, 哦，这样啊，我大概明白你的意思了，我自己再思考一下。恩，你要有空的话，还烦请你给我画个图，留个我的邮箱吧luochai@163.com，真是很感谢你！ 2012-09-29 09:47:13
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-29 14:42:04
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhaoyu2881 at 2012-09-28 22:18:55
恩，是呢，是打算像你说的这样做呢。我只是现在担心，如果P出来的基因不是全长，会不会在抗性基因插入失活之前，我的目的片段就已经不是功能基因了，那到最后转化到宿主后，岂不是不能说明是因为插入而引起的失活了 ...

这个不会呀。因为你是通过同源重组进行双交换，从而使目的基因失活的。你没P的那部分还是野生宿主基因组的，你P的那部分相当于一个平台，把抗性基因引入野生基因从而达到失活的目的。不知道这样说你是不是明白了。实在不明白等我有空画个图给你，最近实在事情太多。
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6楼2012-09-29 08:45:49
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quan3145
祝福   祝福
7楼2012-09-29 09:07:07
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我爱科学2012

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-29 08:45:49
这个不会呀。因为你是通过同源重组进行双交换，从而使目的基因失活的。你没P的那部分还是野生宿主基因组的，你P的那部分相当于一个平台，把抗性基因引入野生基因从而达到失活的目的。不知道这样说你是不是明白了。 ...

希望  你画个图出来，尽量详细哈
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始终热爱生物学，加油，奋斗，将激情燃烧下去...
8楼2013-08-29 21:32:19
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