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多克隆酶切位点可以任意插入基因吗？不用考虑启动子的距离吗？
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我金币多，重重有奖！！： 如图的质粒，在MCS之前有个ptb启动子，用于其后基因的表达；我想问的是启动子后的MCS可以随意选择吗？不需要考虑启动子的距离或者其他序列吗？比如有的文献选用BamHI和AvaI作为外源基因插入位点；有的选择NdeI单酶切插入一个基因也能表达。从序列上看，NdeI位点插入的比BamHI/AvaI位点插入的距离启动子要多130bp呢？这样不经过任何修饰直接插入基因也能表达？ [ Last edited by 看天 on 2013-10-25 at 17:28 ] |
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 分子生化实验经验积累 | 核酸方面 |
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bleach060452
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【答案】应助回帖
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看天: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 我也经常听别人强调读码框要正确，请问还会有造成某个基因读码框混乱的情况吗？ 2013-10-28 17:30:03
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:33:59
gyesang: 回帖置顶 2013-10-29 16:34:38
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启动子和起始密码子是两回事，往往MCS中启动子到起始密码子（第一个氨基酸）中间会有一段距离（如表达载体，一般用来放置一些表达调控元件），对最终表达的目的蛋白是没影响的。 至于插入位置，需要考虑：排除目的基因中含有的的酶切位点与MCS中相同的酶； 融合蛋白（载体提供，包括一些标签蛋白）是否需要，对目的蛋白是否有影响； 最关键的一点，读码框要正确； 然后还有一些理论外要考虑的，如酶是否常见好用、价格、是否有甲基化等麻烦等等~~ 通过这些的，理论上都能用，看你喜好怎么用了~~ P.S.：单酶切位点插目的基因时有一个麻烦，需要验证目的基因的“反正”，因为目的片段两侧是一样的粘性末端。 |
4楼2013-10-28 14:42:17
zhouxiaofei
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【答案】应助回帖
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看天: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 翻译不是只有从目的基因的ATG开始的吗？过克隆位点就已经开始翻译了？ 2013-11-06 23:04:10
看天: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 翻译不是只有从目的基因的ATG开始的吗？过克隆位点就已经开始翻译了？ 2013-11-06 23:04:10
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当然要考虑！但不是考虑启动子的位置，要考虑你用的酶切位点到你目的基因的ATG的距离是不是3的整倍数，如果不是，那就移码了，岂不是全乱了。 你要看的不是简单的质粒图谱，而是要看质粒文件中给的一段核算序列的标注。多克隆位点也是能够翻译出一段多肽的，你还不知道吗？不同的酶切位点到你目的基因的ATG的距离可不总是3的整数倍，有的错（开）1个，有的错2个，有的错3个，只有错3个的才行！ |
8楼2013-11-02 09:08:51
bleach060452
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9楼2013-11-04 10:08:44
