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看天

木虫 (知名作家)

[求助] 多克隆酶切位点可以任意插入基因吗？不用考虑启动子的距离吗？

我金币多，重重有奖！！：
多克隆酶切位点可以任意插入基因吗？不用考虑启动子的距离吗？
如图的质粒，在MCS之前有个ptb启动子，用于其后基因的表达；我想问的是启动子后的MCS可以随意选择吗？不需要考虑启动子的距离或者其他序列吗？比如有的文献选用BamHI和AvaI作为外源基因插入位点；有的选择NdeI单酶切插入一个基因也能表达。从序列上看，NdeI位点插入的比BamHI/AvaI位点插入的距离启动子要多130bp呢？这样不经过任何修饰直接插入基因也能表达？

[ Last edited by 看天 on 2013-10-25 at 17:28 ]
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1楼 2013-10-25 17:27:39
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 我也经常听别人强调读码框要正确，请问还会有造成某个基因读码框混乱的情况吗？ 2013-10-28 17:30:03
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:33:59
gyesang: 回帖置顶 2013-10-29 16:34:38
启动子和起始密码子是两回事，往往MCS中启动子到起始密码子（第一个氨基酸）中间会有一段距离（如表达载体，一般用来放置一些表达调控元件），对最终表达的目的蛋白是没影响的。

至于插入位置，需要考虑：排除目的基因中含有的的酶切位点与MCS中相同的酶；
                                    融合蛋白（载体提供，包括一些标签蛋白）是否需要，对目的蛋白是否有影响；
                                    最关键的一点，读码框要正确；
                                    然后还有一些理论外要考虑的，如酶是否常见好用、价格、是否有甲基化等麻烦等等~~
                                   通过这些的，理论上都能用，看你喜好怎么用了~~
P.S.：单酶切位点插目的基因时有一个麻烦，需要验证目的基因的“反正”，因为目的片段两侧是一样的粘性末端。
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岂能尽如人意，但求无愧我心
4楼2013-10-28 14:42:17
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zhouxiaofei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+15, ★★★★★最佳答案, 是通过PCR的时候直接通过设计引物加入吗？ 2013-10-28 17:31:03
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:34:22
gyesang: 回帖置顶 2013-10-29 16:34:39
没有影响的，MCS的意思是你在里面任意位置插入基因片段都不会影响转录的。如果你要做启动表达，如果真核表达最好在ATG前加入GCCACC序列，kozak序列，帮助表达。
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5楼2013-10-28 15:15:29
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普通回帖

看天

木虫 (知名作家)
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
2楼2013-10-27 23:19:10
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看天

木虫 (知名作家)
来人给回答
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3楼2013-10-28 13:44:54
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bleach060452

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:34:30
一般确定上游的酶切位点和基因起始处的读码框正确，基本上就不会有问题了吧~~
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岂能尽如人意，但求无愧我心
6楼2013-10-29 16:18:24
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看天

木虫 (知名作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-10-29 16:18:24
一般确定上游的酶切位点和基因起始处的读码框正确，基本上就不会有问题了吧~~

如果我在一个基因里面插入一段外源序列，那么这个基因本身是失活了，但是它的转录还会继续进行吗，如果我要做RT-PCR,引物设计在插入位点之前，这个基因会不会还有表达被测出来？
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7楼2013-11-01 22:47:01
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iayala

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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看天: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 翻译不是只有从目的基因的ATG开始的吗？过克隆位点就已经开始翻译了？ 2013-11-06 23:04:10
当然要考虑！但不是考虑启动子的位置，要考虑你用的酶切位点到你目的基因的ATG的距离是不是3的整倍数，如果不是，那就移码了，岂不是全乱了。
你要看的不是简单的质粒图谱，而是要看质粒文件中给的一段核算序列的标注。多克隆位点也是能够翻译出一段多肽的，你还不知道吗？不同的酶切位点到你目的基因的ATG的距离可不总是3的整数倍，有的错（开）1个，有的错2个，有的错3个，只有错3个的才行！
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8楼2013-11-02 09:08:51
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bleach060452

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 看天 at 2013-11-01 22:47:01
如果我在一个基因里面插入一段外源序列，那么这个基因本身是失活了，但是它的转录还会继续进行吗，如果我要做RT-PCR,引物设计在插入位点之前，这个基因会不会还有表达被测出来？...

以我的理解应该是会的~~ 但是负责的说，我不确定，没这么做过。建议找个明白人问问，或者干脆找篇文献一看便知。
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岂能尽如人意，但求无愧我心
9楼2013-11-04 10:08:44
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