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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于体外转录的模板
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谁知道

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于体外转录的模板 已有6人参与

今天在一片文献上看到：体外转录的模板可以是带有T7启动子的DNA的PCR产物，也可以是含目的DNA的线性化的质粒。有几个问题不太清楚：
1.如果模板选用带启动子的PCR产物，在进行体外转录前，P出了来的产物需要测序吗，如果需要，又该怎么测呢？
2.如果模板选用线性化质粒，将目的片段连子载体T7启动子下游后，启动子与目的片段之间的多余序列会不会影响转录产物啊？
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每个人一辈子从来都是一个人
1楼 2010-05-27 19:49:28
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎多多交流~ 2010-05-29 09:36:59
你提的问题很好。首先回答第一个问题：用带有T7启动子的DNA的PCR产物做模板不用测序，但最好是用酚氯仿抽提后，取少量做个单酶切（从PCR产物内部找个酶切位点），看看大小是否跟预期的一致。但一般不用这种模板。第二种模板的启动子与目的片段之间的多余序列不会影响转录。尽管用。我们都是用第二种模板。
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boby922
2楼2010-05-28 08:18:42
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谁知道

铁虫 (小有名气)
呵呵，学习了，吗、那么请问常用于做体外转录的含T7启动子的质粒都有哪些啊？因为我的目的片段很短，只有100nt，想找一个启动子与多克隆位点之间距离较短的质粒，谢谢啦！
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每个人一辈子从来都是一个人
3楼2010-05-28 14:55:12
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谁知道

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-05-28 08:18:42:
你提的问题很好。首先回答第一个问题：用带有T7启动子的DNA的PCR产物做模板不用测序，但最好是用酚氯仿抽提后，取少量做个单酶切（从PCR产物内部找个酶切位点），看看大小是否跟预期的一致。但一般不用这种模板。 ...

呵呵，学习了，那么请问常用于做体外转录的含T7启动子的质粒都有哪些啊？因为我的目的片段很短，只有100nt，想找一个启动子与多克隆位点之间距离较短的质粒，谢谢啦！
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每个人一辈子从来都是一个人
4楼2010-05-28 14:55:51
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 22:01:18
pGEM T-easy 就行，也最常用。不过，既然你的目的片段太短，那就用带启动子的PCR产物，但要用超保真酶来扩。或者，更稳妥的办法是，先扩增你的片段，然后测序，选无错误碱基的克隆提取质粒，再从质粒上扩增带启动子的目的片段。
   祝你好运！
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5楼2010-05-29 18:16:32
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lilyjimei

新虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
也想请教下如何设计带有T7启动子的某序列的引物？T7引物和T7启动子是相同还是互补序列呢？因急用期待尽快回复，O(∩_∩)O谢谢!
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6楼2012-05-15 14:18:55
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boby922

新虫 (初入文坛)
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143281楼: Originally posted by lixg at 2010-05-28 08:18:42
你提的问题很好。首先回答第一个问题：用带有T7启动子的DNA的PCR产物做模板不用测序，但最好是用酚氯仿抽提后，取少量做个单酶切（从PCR产物内部找个酶切位点），看看大小是否跟预期的一致。但一般不用这种模板。第 ...

请问如果用于显微注射的话，只有T7启动子，kozak和目的基因的ORF区，可以体外转录，纯化后用于注射么？没有polyA对稳定性影响不大吧？如果线性化酶切位点距离终止密码子比较远是不是不太好？例如2KB左右？因为我用pcdna3.1，在bgh的polyA后面附近没有合适的酶切位点呀。只搜到BbsI位点（GAAGAC(N)2)，这个酶怎么样？
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xuesen1223
7楼2012-06-14 21:26:40
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xuesen1223

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by boby922 at 2012-06-14 21:26:40
请问如果用于显微注射的话，只有T7启动子，kozak和目的基因的ORF区，可以体外转录，纯化后用于注射么？没有polyA对稳定性影响不大吧？如果线性化酶切位点距离终止密码子比较远是不是不太好？例如2KB左右？因为我用 ...

亲 我用的也是pcDNA3，单酶切想用SmaI，距离终止子1000bp，会有影响吗
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8楼2014-06-02 13:37:53
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zhenlizhao

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by lixg at 2010-05-29 18:16:32
pGEM T-easy 就行，也最常用。不过，既然你的目的片段太短，那就用带启动子的PCR产物，但要用超保真酶来扩。或者，更稳妥的办法是，先扩增你的片段，然后测序，选无错误碱基的克隆提取质粒，再从质粒上扩增带启动子 ...

你好，我想问下你用PGEM-T载体做体外转录的模板时，用什么酶线性化资粒
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9楼2015-07-21 17:40:16
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