应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于体外转录的模板
91/1返回列表
查看: 7094  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

谁知道

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于体外转录的模板 已有6人参与

今天在一片文献上看到：体外转录的模板可以是带有T7启动子的DNA的PCR产物，也可以是含目的DNA的线性化的质粒。有几个问题不太清楚：
1.如果模板选用带启动子的PCR产物，在进行体外转录前，P出了来的产物需要测序吗，如果需要，又该怎么测呢？
2.如果模板选用线性化质粒，将目的片段连子载体T7启动子下游后，启动子与目的片段之间的多余序列会不会影响转录产物啊？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
每个人一辈子从来都是一个人
1楼 2010-05-27 19:49:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎多多交流~ 2010-05-29 09:36:59
你提的问题很好。首先回答第一个问题：用带有T7启动子的DNA的PCR产物做模板不用测序，但最好是用酚氯仿抽提后，取少量做个单酶切（从PCR产物内部找个酶切位点），看看大小是否跟预期的一致。但一般不用这种模板。第二种模板的启动子与目的片段之间的多余序列不会影响转录。尽管用。我们都是用第二种模板。
赞一下(3人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

boby922
2楼2010-05-28 08:18:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

谁知道

铁虫 (小有名气)
呵呵，学习了，吗、那么请问常用于做体外转录的含T7启动子的质粒都有哪些啊？因为我的目的片段很短，只有100nt，想找一个启动子与多克隆位点之间距离较短的质粒，谢谢啦！
赞一下 回复此楼
每个人一辈子从来都是一个人
3楼2010-05-28 14:55:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

谁知道

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-05-28 08:18:42:
你提的问题很好。首先回答第一个问题：用带有T7启动子的DNA的PCR产物做模板不用测序，但最好是用酚氯仿抽提后，取少量做个单酶切（从PCR产物内部找个酶切位点），看看大小是否跟预期的一致。但一般不用这种模板。 ...

呵呵，学习了，那么请问常用于做体外转录的含T7启动子的质粒都有哪些啊？因为我的目的片段很短，只有100nt，想找一个启动子与多克隆位点之间距离较短的质粒，谢谢啦！
赞一下 回复此楼
每个人一辈子从来都是一个人
4楼2010-05-28 14:55:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 22:01:18
pGEM T-easy 就行，也最常用。不过，既然你的目的片段太短，那就用带启动子的PCR产物，但要用超保真酶来扩。或者，更稳妥的办法是，先扩增你的片段，然后测序，选无错误碱基的克隆提取质粒，再从质粒上扩增带启动子的目的片段。
   祝你好运！
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2010-05-29 18:16:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lilyjimei

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
也想请教下如何设计带有T7启动子的某序列的引物？T7引物和T7启动子是相同还是互补序列呢？因急用期待尽快回复，O(∩_∩)O谢谢!
赞一下 回复此楼
6楼2012-05-15 14:18:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

boby922

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
引用回帖:
143281楼: Originally posted by lixg at 2010-05-28 08:18:42
你提的问题很好。首先回答第一个问题：用带有T7启动子的DNA的PCR产物做模板不用测序，但最好是用酚氯仿抽提后，取少量做个单酶切（从PCR产物内部找个酶切位点），看看大小是否跟预期的一致。但一般不用这种模板。第 ...

请问如果用于显微注射的话，只有T7启动子，kozak和目的基因的ORF区，可以体外转录，纯化后用于注射么？没有polyA对稳定性影响不大吧？如果线性化酶切位点距离终止密码子比较远是不是不太好？例如2KB左右？因为我用pcdna3.1，在bgh的polyA后面附近没有合适的酶切位点呀。只搜到BbsI位点（GAAGAC(N)2)，这个酶怎么样？
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xuesen1223
7楼2012-06-14 21:26:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuesen1223

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by boby922 at 2012-06-14 21:26:40
请问如果用于显微注射的话，只有T7启动子，kozak和目的基因的ORF区，可以体外转录，纯化后用于注射么？没有polyA对稳定性影响不大吧？如果线性化酶切位点距离终止密码子比较远是不是不太好？例如2KB左右？因为我用 ...

亲 我用的也是pcDNA3，单酶切想用SmaI，距离终止子1000bp，会有影响吗
赞一下 回复此楼
8楼2014-06-02 13:37:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhenlizhao

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by lixg at 2010-05-29 18:16:32
pGEM T-easy 就行，也最常用。不过，既然你的目的片段太短，那就用带启动子的PCR产物，但要用超保真酶来扩。或者，更稳妥的办法是，先扩增你的片段，然后测序，选无错误碱基的克隆提取质粒，再从质粒上扩增带启动子 ...

你好，我想问下你用PGEM-T载体做体外转录的模板时，用什么酶线性化资粒
赞一下 回复此楼
9楼2015-07-21 17:40:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 谁知道 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭