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谁知道

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于体外转录的模板已有6人参与

今天在一片文献上看到:体外转录的模板可以是带有T7启动子的DNA的PCR产物,也可以是含目的DNA的线性化的质粒。有几个问题不太清楚:
1.如果模板选用带启动子的PCR产物,在进行体外转录前,P出了来的产物需要测序吗,如果需要,又该怎么测呢?
2.如果模板选用线性化质粒,将目的片段连子载体T7启动子下游后,启动子与目的片段之间的多余序列会不会影响转录产物啊?
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zhenlizhao

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by lixg at 2010-05-29 18:16:32
pGEM T-easy 就行,也最常用。不过,既然你的目的片段太短,那就用带启动子的PCR产物,但要用超保真酶来扩。或者,更稳妥的办法是,先扩增你的片段,然后测序,选无错误碱基的克隆提取质粒,再从质粒上扩增带启动子 ...

你好,我想问下你用PGEM-T载体做体外转录的模板时,用什么酶线性化资粒
9楼2015-07-21 17:40:16
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎多多交流~ 2010-05-29 09:36:59
你提的问题很好。首先回答第一个问题:用带有T7启动子的DNA的PCR产物做模板不用测序,但最好是用酚氯仿抽提后,取少量做个单酶切(从PCR产物内部找个酶切位点),看看大小是否跟预期的一致。但一般不用这种模板。第二种模板的启动子与目的片段之间的多余序列不会影响转录。尽管用。我们都是用第二种模板。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2010-05-28 08:18:42
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谁知道

铁虫 (小有名气)

呵呵,学习了,吗、那么请问常用于做体外转录的含T7启动子的质粒都有哪些啊?因为我的目的片段很短,只有100nt,想找一个启动子与多克隆位点之间距离较短的质粒,谢谢啦!
每个人一辈子从来都是一个人
3楼2010-05-28 14:55:12
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谁知道

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-05-28 08:18:42:
你提的问题很好。首先回答第一个问题:用带有T7启动子的DNA的PCR产物做模板不用测序,但最好是用酚氯仿抽提后,取少量做个单酶切(从PCR产物内部找个酶切位点),看看大小是否跟预期的一致。但一般不用这种模板。 ...

呵呵,学习了,那么请问常用于做体外转录的含T7启动子的质粒都有哪些啊?因为我的目的片段很短,只有100nt,想找一个启动子与多克隆位点之间距离较短的质粒,谢谢啦!
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4楼2010-05-28 14:55:51
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