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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于体外转录的模板
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谁知道

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于体外转录的模板已有6人参与

今天在一片文献上看到：体外转录的模板可以是带有T7启动子的DNA的PCR产物，也可以是含目的DNA的线性化的质粒。有几个问题不太清楚：
1.如果模板选用带启动子的PCR产物，在进行体外转录前，P出了来的产物需要测序吗，如果需要，又该怎么测呢？
2.如果模板选用线性化质粒，将目的片段连子载体T7启动子下游后，启动子与目的片段之间的多余序列会不会影响转录产物啊？
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每个人一辈子从来都是一个人
1楼2010-05-27 19:49:28
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎多多交流~ 2010-05-29 09:36:59
你提的问题很好。首先回答第一个问题：用带有T7启动子的DNA的PCR产物做模板不用测序，但最好是用酚氯仿抽提后，取少量做个单酶切（从PCR产物内部找个酶切位点），看看大小是否跟预期的一致。但一般不用这种模板。第二种模板的启动子与目的片段之间的多余序列不会影响转录。尽管用。我们都是用第二种模板。
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boby922
2楼2010-05-28 08:18:42
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-05-29 22:01:18
pGEM T-easy 就行，也最常用。不过，既然你的目的片段太短，那就用带启动子的PCR产物，但要用超保真酶来扩。或者，更稳妥的办法是，先扩增你的片段，然后测序，选无错误碱基的克隆提取质粒，再从质粒上扩增带启动子的目的片段。
   祝你好运！
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5楼2010-05-29 18:16:32
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