| 查看: 6114 | 回复: 8 | |||
[交流]
双酶切后载体片段变小
|
|
本人实验中遇到点问题，现将详细过程书写如下，并附带详细的参考信息。 目的基因长度：900bp 目的基因的前端有NdeI酶切位点，后端有BamHI酶切位点。目的基因是由公司合成好以后构建到pGEM-T载体上，转化到DH5α中。 pET3a（大小4640bp） pET20b（大小3716bp） 以及pGEM-T（大小3000bp）都是转化到DH5α中，提取质粒以后做双酶切的时候都载体的大小正确（如图1），可以排除同源重组的可能性。  图1 （图1）提取质粒后做双酶切，从图中可以看到pET3a和pT-taget质粒都已经完全切开，且载体与目的基因的大小都正确。注：pT-taget双酶切以后载体有两条带，这是因为目的基因和T载体上都带有NdeI酶切位点，目的基因的末端A与T载体的T相连时存在正反向相连两种情况，目的基因大小为900bp左右，所以在没有完全切开质粒的时候载体会与两种情况，大小相差900bp左右。  图2 （图2）目的基因双酶切后分别与pET3a和pET20b相连接，转化DH5α细胞，挑取单克隆提质粒双酶切后的电泳结果。图中用DH5α中提取的pET3a和pET20b质粒做的双酶切作为载体的对照；连接后双酶切目的基因的条带大小正确，但载体的大小发生改变，都比原先载体片段小。 我的问题就是，为什么连接了以后原先的载体会变小（已经重复了多次实验，更换了感受态细胞，重新提质粒，重新酶切的载体等等）。  图3 （图3）pET3a-target与pET20b-target分别用NdeI和BamHI做单酶切；3a加目的基因条带应该在5000左右，处于Marker10000中从上数第三条带4000以上，然而切出来的条带位于4000一下；同样，20b载体单酶切后加上目的条带也应在4000以上。 总的来说，目的基因连入载体以后，载体序列酶切后发生的构象的改变，导致条带位置发生改变，请问这具体的原因是什么呢？  pGEM-T  pET-3a  pET-20b [ Last edited by shoppinggirl on 2012-8-18 at 19:13 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有130人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- PBI121载体与目的片段连接后双酶切问题
已经有23人回复
- 片段连接到载体后，总在酶切位点处发生缺失
已经有5人回复
- 双酶切后如何才能让载体自连？
已经有6人回复
- T载体上的酶切位点
已经有4人回复
- 请教关于载体中酶切位点和插入片段的问题
已经有12人回复
- 单酶切后的载体和目的片段是否都需要去磷酸化
已经有4人回复
- pMD19-T双酶切，目的片段上酶切位点和载体上一样
已经有7人回复
- pMD18-T载体连接了目的片段后双酶切鉴定出现了好多条带 怎么回事?
已经有6人回复
- 酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？
已经有14人回复
- 载体酶切位点与目的片段重复
已经有13人回复
- 关于双酶切作用时间
已经有10人回复
- t载体酶切问题
已经有15人回复
- pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
已经有23人回复
- pMD18-T载体不需要酶切吗
已经有10人回复
- 双酶切后目的条带很淡，回收不到
已经有15人回复
- 质粒提取 酶切 T载体与目的基因
已经有5人回复
- PET-30a 双酶切
已经有4人回复
- 载体和酶切片段连接的问题
已经有5人回复
- T载体酶切片段与目的片段大小不一致
已经有12人回复
- 【求助/交流】片段转进去，提质粒酶切发现载体小了，想不明白
已经有19人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
散金祈福
+3/1122
-
华西生物制药研究院招聘科研助理
+2/452
-
五大联赛看好哪支球队
+5/315
-
散金求好运
+1/266
-
2026年财务管理、经济与信息技术国际会议 (FMEIT 2026)
+1/132
-
面上基金祈福
+1/129
-
山东征女友，坐标济南
+1/91
-
上海交通大学张航课题组招聘博士后（电化学能量存储与转换）
+1/79
-
哈尔滨工业大学（校本部）电子与信息工程学院2027级博士招生
+1/78
-
散金币祈福
+1/55
-
散金祈福，求面上立项、肯德基
+2/38
-
5年了，散金祈愿面上得中，愿望成真再散十倍
+1/23
-
南京医科大学-冯璋课题组-招收2027级生化与分子生物学专业博士和硕士研究生
+1/3
-
北京理工大学-集成电路与电子学院杰青团队-招博士后
+1/3
-
河海大学海洋环境污染与生态毒理学研究组招收2027级硕士生 及博士研究生
+1/2
-
北理工集成电路杰青团队 | 诚招科助理
+1/2
-
老虫友
+1/2
-
偶然点开小木虫，发现十年已经过去了
+1/2
-
中国科学院生物物理研究所田勇课题组招聘联合培养生
+1/2
-
清华大学环境课题组招聘环境工作专业客座生研究生2-3名（应用导向）
+1/1
2楼2012-08-19 13:59:08
3楼2012-08-19 19:05:07
4楼2012-08-20 00:20:55
5楼2012-08-20 00:21:40
6楼2012-08-20 12:52:00
7楼2015-03-19 16:39:24
8楼2015-09-22 17:06:04
9楼2019-06-03 21:11:43
