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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后载体片段变小
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shoppinggirl

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 双酶切后载体片段变小

本人实验中遇到点问题，现将详细过程书写如下，并附带详细的参考信息。
目的基因长度：900bp
目的基因的前端有NdeI酶切位点，后端有BamHI酶切位点。目的基因是由公司合成好以后构建到pGEM-T载体上，转化到DH5α中。
pET3a（大小4640bp） pET20b（大小3716bp） 以及pGEM-T（大小3000bp）都是转化到DH5α中，提取质粒以后做双酶切的时候都载体的大小正确（如图1），可以排除同源重组的可能性。

图1
（图1）提取质粒后做双酶切，从图中可以看到pET3a和pT-taget质粒都已经完全切开，且载体与目的基因的大小都正确。注：pT-taget双酶切以后载体有两条带，这是因为目的基因和T载体上都带有NdeI酶切位点，目的基因的末端A与T载体的T相连时存在正反向相连两种情况，目的基因大小为900bp左右，所以在没有完全切开质粒的时候载体会与两种情况，大小相差900bp左右。

图2
（图2）目的基因双酶切后分别与pET3a和pET20b相连接，转化DH5α细胞，挑取单克隆提质粒双酶切后的电泳结果。图中用DH5α中提取的pET3a和pET20b质粒做的双酶切作为载体的对照；连接后双酶切目的基因的条带大小正确，但载体的大小发生改变，都比原先载体片段小。
我的问题就是，为什么连接了以后原先的载体会变小（已经重复了多次实验，更换了感受态细胞，重新提质粒，重新酶切的载体等等）。

图3
（图3）pET3a-target与pET20b-target分别用NdeI和BamHI做单酶切；3a加目的基因条带应该在5000左右，处于Marker10000中从上数第三条带4000以上，然而切出来的条带位于4000一下；同样，20b载体单酶切后加上目的条带也应在4000以上。

总的来说，目的基因连入载体以后，载体序列酶切后发生的构象的改变，导致条带位置发生改变，请问这具体的原因是什么呢？



pGEM-T



pET-3a



pET-20b

[ Last edited by shoppinggirl on 2012-8-18 at 19:13 ]
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1楼 2012-08-18 09:05:06
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taojun

木虫 (著名写手)
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原始载体两个酶切位点间想多多少BP呢
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2楼2012-08-19 13:59:08
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zhangj0754

木虫 (小有名气)
★
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我也遇到过这样的问题，后来重新酶切做了一次就好了。
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3楼2012-08-19 19:05:07
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shoppinggirl

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by taojun at 2012-08-19 13:59:08
原始载体两个酶切位点间想多多少BP呢

就多 30几个bp
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4楼2012-08-20 00:20:55
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shoppinggirl

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangj0754 at 2012-08-19 19:05:07
我也遇到过这样的问题，后来重新酶切做了一次就好了。

我已经重新酶切了三遍以上了，都是这个结果 ，这里的图片是比较好看的，我选出来放上去的。
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5楼2012-08-20 00:21:40
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taojun

木虫 (著名写手)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangj0754 at 2012-08-19 19:05:07
我也遇到过这样的问题，后来重新酶切做了一次就好了。

两个酶切位点相差这么少啊，你跑焦的时候用2%的胶试试啊！
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6楼2012-08-20 12:52:00
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毛阿洋

铁虫 (初入文坛)
★
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你好，这个问题解决了吗？怎么解决的哈，我也遇到了同样的问题哈，载体变小了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2015-03-19 16:39:24
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
★
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我也遇到了这种情况，请问是否是六楼所说的胶的问题呢，期待您的回复。。。谢谢
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8楼2015-09-22 17:06:04
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xinxinjin

银虫 (知名作家)
★
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8楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-22 17:06:04
我也遇到了这种情况，请问是否是六楼所说的胶的问题呢，期待您的回复。。。谢谢

你用2％的胶跑电泳了吗
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9楼2019-06-03 21:11:43
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