应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后载体片段变小
51/1返回列表
查看: 6216  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

shoppinggirl

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 双酶切后载体片段变小

本人实验中遇到点问题，现将详细过程书写如下，并附带详细的参考信息。
目的基因长度：900bp
目的基因的前端有NdeI酶切位点，后端有BamHI酶切位点。目的基因是由公司合成好以后构建到pGEM-T载体上，转化到DH5α中。
pET3a（大小4640bp） pET20b（大小3716bp） 以及pGEM-T（大小3000bp）都是转化到DH5α中，提取质粒以后做双酶切的时候都载体的大小正确（如图1），可以排除同源重组的可能性。

图1
（图1）提取质粒后做双酶切，从图中可以看到pET3a和pT-taget质粒都已经完全切开，且载体与目的基因的大小都正确。注：pT-taget双酶切以后载体有两条带，这是因为目的基因和T载体上都带有NdeI酶切位点，目的基因的末端A与T载体的T相连时存在正反向相连两种情况，目的基因大小为900bp左右，所以在没有完全切开质粒的时候载体会与两种情况，大小相差900bp左右。

图2
（图2）目的基因双酶切后分别与pET3a和pET20b相连接，转化DH5α细胞，挑取单克隆提质粒双酶切后的电泳结果。图中用DH5α中提取的pET3a和pET20b质粒做的双酶切作为载体的对照；连接后双酶切目的基因的条带大小正确，但载体的大小发生改变，都比原先载体片段小。
我的问题就是，为什么连接了以后原先的载体会变小（已经重复了多次实验，更换了感受态细胞，重新提质粒，重新酶切的载体等等）。

图3
（图3）pET3a-target与pET20b-target分别用NdeI和BamHI做单酶切；3a加目的基因条带应该在5000左右，处于Marker10000中从上数第三条带4000以上，然而切出来的条带位于4000一下；同样，20b载体单酶切后加上目的条带也应在4000以上。

总的来说，目的基因连入载体以后，载体序列酶切后发生的构象的改变，导致条带位置发生改变，请问这具体的原因是什么呢？



pGEM-T



pET-3a



pET-20b

[ Last edited by shoppinggirl on 2012-8-18 at 19:13 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-08-18 09:05:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到了这种情况，请问是否是六楼所说的胶的问题呢，期待您的回复。。。谢谢
赞一下 回复此楼
8楼2015-09-22 17:06:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

taojun

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
原始载体两个酶切位点间想多多少BP呢
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-19 13:59:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangj0754

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到过这样的问题，后来重新酶切做了一次就好了。
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-19 19:05:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shoppinggirl

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by taojun at 2012-08-19 13:59:08
原始载体两个酶切位点间想多多少BP呢

就多 30几个bp
回复此楼
4楼2012-08-20 00:20:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭