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justdilo

木虫 (著名写手)

[交流] 酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？

楼主这几天在做酶切，酶切前取PCR产物4ul电泳，EB泡胶，条带清晰。用Xsp I酶切，20ul体系，加入上述PCR产物6ul或4ul，37度反应50min，然后3%琼脂糖电泳，加样量10ul，EB泡胶，电泳检测，发现条带大幅度变暗，甚至直接不见了。有没有大侠指点一下这是什么个情况？这个酶切以前也做过，没有出现类似的情况。最近比较热，实验室没空调，室温34度左右，会是温度的影响吗？
第一张图是PCR产物电泳，4ul；第二张是酶切图，加PCR产物4ul；第三张是PCR图，4ul；第四张是酶切图，左侧加PCR产物6ul，右侧是4ul。
酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？
2013.07.27kuo.jpg


酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？-1
2013.07.27.jpg


酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？-2
2013.07.29kuo.jpg


酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？-3
2013.07.29qie.jpg

[ Last edited by justdilo on 2013-7-29 at 21:47 ]
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1楼 2013-07-29 21:38:18
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Sthunder

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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myprayer: 金币+1, 分子生物期待你的精彩 2013-07-29 22:38:45
justdilo: 金币+2 2013-07-30 08:46:54
虽然酶切产物电泳时加样量都是10ul，但也要看你酶切体系中加入PCR的量。此外，你PCR产物酶切之前也需要纯化啊，纯化过程中肯定有损失的。一般下游需要酶切的话，我们PCR采用50 uL体系，纯化至30 ul体系，然后加25uL做酶切。Good luck！
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3楼2013-07-29 22:16:36
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taojun

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
justdilo: 金币+1 2013-07-30 08:48:29
你做酶切的时候PCR产物回收了吗？我们在做酶切的时候操作都是放在冰上的，还有怎么你的酶切条带大小不太对啊，左边和右边的是同一种PCR产物吗？
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4楼2013-07-29 22:52:42
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justdilo

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by piggpi at 2013-07-30 10:55:19
楼主，看这电泳图，酶切前后的大小没什么变化呀，？你的目的是通过PCR加上酶切位点，然后做酶切，后续再做载体构建是吗？
另外，我们一般不会拿PCR产物直接酶切，PCR体系里的盐离子会影响酶切效率，建议回收。
还 ...

加大了DNA的量，问题已解决，谢谢你。
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14楼2013-08-01 08:43:05
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普通回帖

justdilo

木虫 (著名写手)
酶切产物电泳时加样量都是10ul
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2楼2013-07-29 21:43:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
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justdilo: 金币+1 2013-07-30 08:49:21
从你的加样量看，酶切产物比PCR样品少一半，酶切后条带暗的图上的marker也比较暗，可能与曝光时间及核酸染料有关，所以我觉得问题不是很大。
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5楼2013-07-29 23:16:05
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justdilo

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-29 22:16:36
虽然酶切产物电泳时加样量都是10ul，但也要看你酶切体系中加入PCR的量。此外，你PCR产物酶切之前也需要纯化啊，纯化过程中肯定有损失的。一般下游需要酶切的话，我们PCR采用50 uL体系，纯化至30 ul体系，然后加25uL ...

我们是直接PCR产物酶切，不经纯化的，所以加入的PCR产物量应该是够的，6月份用相同的条件做的，条带都很亮。
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6楼2013-07-30 08:46:48
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justdilo

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by taojun at 2013-07-29 22:52:42
你做酶切的时候PCR产物回收了吗？我们在做酶切的时候操作都是放在冰上的，还有怎么你的酶切条带大小不太对啊，左边和右边的是同一种PCR产物吗？

没有回收，直接在室温下做的，看来下次再做要注意控温。
我酶切完后条带大小是不一样，看多态性的。
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7楼2013-07-30 08:48:08
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justdilo

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-29 23:16:05
从你的加样量看，酶切产物比PCR样品少一半，酶切后条带暗的图上的marker也比较暗，可能与曝光时间及核酸染料有关，所以我觉得问题不是很大。

那我该怎样改进呢？
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8楼2013-07-30 08:49:15
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忘忧草_

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
注意控制实验过程的温度啊！还有，你用的快速内切酶还是普通的啊？
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9楼2013-07-30 09:05:00
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pypsak

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
看多态性，酶切位点设计业不太好，酶切后就一个条带说服力不太好，最好带差异的2条带
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10楼2013-07-30 09:38:25
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taojun

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by justdilo at 2013-07-30 08:48:08
没有回收，直接在室温下做的，看来下次再做要注意控温。
我酶切完后条带大小是不一样，看多态性的。...

哦，明白了啊，不回收的话直接酶切会出现这种情况的啊，因为PCR体系里面的离子会对酶切反应造成影响的啊，你回收一下再酶切就好了！
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11楼2013-07-30 10:39:44
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piggpi

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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justdilo: 金币+5 2013-08-01 08:43:13
楼主，看这电泳图，酶切前后的大小没什么变化呀，？你的目的是通过PCR加上酶切位点，然后做酶切，后续再做载体构建是吗？
另外，我们一般不会拿PCR产物直接酶切，PCR体系里的盐离子会影响酶切效率，建议回收。
还有，所有的胶图的Marker跑得都很漂亮，应该说胶和环境温度等等因素影响不大，是不是可以先暂时不考虑这个？
觉得主要是还是酶切的量不够，这些胶图判断不出PCR产物浓度，4ul到底有多少量呢？如果后期是要做载体构建的话，可以酶切得多一点
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12楼2013-07-30 10:55:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by justdilo at 2013-07-30 08:49:15
那我该怎样改进呢？...

PCR产物回收定量后再做酶切，跑电泳时用同样量的DNA。
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13楼2013-07-30 10:57:43
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wswsjz

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
努力搞科研，祝早日出成果！
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15楼2013-08-01 09:03:47
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