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justdilo

木虫 (著名写手)

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[交流] 酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？

楼主这几天在做酶切，酶切前取PCR产物4ul电泳，EB泡胶，条带清晰。用Xsp I酶切，20ul体系，加入上述PCR产物6ul或4ul，37度反应50min，然后3%琼脂糖电泳，加样量10ul，EB泡胶，电泳检测，发现条带大幅度变暗，甚至直接不见了。有没有大侠指点一下这是什么个情况？这个酶切以前也做过，没有出现类似的情况。最近比较热，实验室没空调，室温34度左右，会是温度的影响吗？
第一张图是PCR产物电泳，4ul；第二张是酶切图，加PCR产物4ul；第三张是PCR图，4ul；第四张是酶切图，左侧加PCR产物6ul，右侧是4ul。

2013.07.27kuo.jpg

2013.07.27.jpg

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2013.07.29qie.jpg

[ Last edited by justdilo on 2013-7-29 at 21:47 ]

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1楼 2013-07-29 21:38:18

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piggpi

金虫 (小有名气)

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justdilo: 金币+5 2013-08-01 08:43:13

楼主，看这电泳图，酶切前后的大小没什么变化呀，？你的目的是通过PCR加上酶切位点，然后做酶切，后续再做载体构建是吗？
另外，我们一般不会拿PCR产物直接酶切，PCR体系里的盐离子会影响酶切效率，建议回收。
还有，所有的胶图的Marker跑得都很漂亮，应该说胶和环境温度等等因素影响不大，是不是可以先暂时不考虑这个？
觉得主要是还是酶切的量不够，这些胶图判断不出PCR产物浓度，4ul到底有多少量呢？如果后期是要做载体构建的话，可以酶切得多一点