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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？
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justdilo

木虫 (著名写手)

[交流] 酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？

楼主这几天在做酶切，酶切前取PCR产物4ul电泳，EB泡胶，条带清晰。用Xsp I酶切，20ul体系，加入上述PCR产物6ul或4ul，37度反应50min，然后3%琼脂糖电泳，加样量10ul，EB泡胶，电泳检测，发现条带大幅度变暗，甚至直接不见了。有没有大侠指点一下这是什么个情况？这个酶切以前也做过，没有出现类似的情况。最近比较热，实验室没空调，室温34度左右，会是温度的影响吗？
第一张图是PCR产物电泳，4ul；第二张是酶切图，加PCR产物4ul；第三张是PCR图，4ul；第四张是酶切图，左侧加PCR产物6ul，右侧是4ul。
酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？
2013.07.27kuo.jpg


酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？-1
2013.07.27.jpg


酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？-2
2013.07.29kuo.jpg


酶切后条带大幅变弱甚至消失是为什么？-3
2013.07.29qie.jpg

[ Last edited by justdilo on 2013-7-29 at 21:47 ]
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1楼 2013-07-29 21:38:18
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Sthunder

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 分子生物期待你的精彩 2013-07-29 22:38:45
justdilo: 金币+2 2013-07-30 08:46:54
虽然酶切产物电泳时加样量都是10ul，但也要看你酶切体系中加入PCR的量。此外，你PCR产物酶切之前也需要纯化啊，纯化过程中肯定有损失的。一般下游需要酶切的话，我们PCR采用50 uL体系，纯化至30 ul体系，然后加25uL做酶切。Good luck！
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3楼2013-07-29 22:16:36
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justdilo

木虫 (著名写手)
酶切产物电泳时加样量都是10ul
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2楼2013-07-29 21:43:24
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taojun

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
justdilo: 金币+1 2013-07-30 08:48:29
你做酶切的时候PCR产物回收了吗？我们在做酶切的时候操作都是放在冰上的，还有怎么你的酶切条带大小不太对啊，左边和右边的是同一种PCR产物吗？
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4楼2013-07-29 22:52:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
justdilo: 金币+1 2013-07-30 08:49:21
从你的加样量看，酶切产物比PCR样品少一半，酶切后条带暗的图上的marker也比较暗，可能与曝光时间及核酸染料有关，所以我觉得问题不是很大。
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5楼2013-07-29 23:16:05
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