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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 空质粒双酶切后出现消失的情况
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 空质粒双酶切后出现消失的情况 已有1人参与

我是试剂盒抽提的质粒
空质粒双酶切后出现消失的情况。
另外，我将空载体PACYC电泳后产物回收放置3天也存在带变弱或者消失的情况
所以后续连接怎么无果

不知怎么解决的 。谢谢各位帮助一下
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1楼 2013-05-07 17:32:00
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tongyanna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
charles08(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-13 10:07:57
我们都是酶切完就直接做连接了，最多放置过一夜，还没有放几天再用的
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charles08
自己的路，自己快乐的走
2楼2013-05-07 18:46:19
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tongyanna at 2013-05-07 18:46:19
我们都是酶切完就直接做连接了，最多放置过一夜，还没有放几天再用的

今天刚做的结果，按标准体系配置酶切体系，
酶切5小时后立即连接过夜，仍然是没有连接上

只看见目的基因片段，没有载体质粒出现

不知何原因？


另外，空载体PACYC质粒电泳后回收后产物也存在降解的问题，三天后即不见带，远不及PCR产物耐储存。不知何原因，怎么解释？？
不知该如何处置？？
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3楼2013-05-07 21:29:56
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by tongyanna at 2013-05-07 18:46:19
我们都是酶切完就直接做连接了，最多放置过一夜，还没有放几天再用的

今天是刚刚提取的质粒就进行酶切，酶切产物先65度灭活15分钟，再纯化回收，再开始连接。电泳结果是载体、目的DNA酶切产物均无带（降解了吧），连接产物也无条带
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4楼2013-05-12 23:35:13
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rainlark

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
5楼2013-05-20 13:22:52
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by rainlark at 2013-05-20 13:22:52
楼主找到原因了吗？我在做实验的时候也遇到了楼主类似的事件

按楼上一位说的直接连接，加大剂量能连上，但是最近又连不上了
带模糊的不行，回收后根本见不了带
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6楼2013-05-21 16:45:12
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tongyanna at 2013-05-07 18:46:19
我们都是酶切完就直接做连接了，最多放置过一夜，还没有放几天再用的

请问你们用来酶切和连接的体系一般是多大的？

我现在双酶切一般没问题，就是连接产物时隐时现。
回收后根本没有带了根本不要说后期操作

我后面要再连一个基因，这没法往下做了
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7楼2013-05-21 16:47:29
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

LZ你好，我最近在做膜蛋白表达，需要一种低拷贝质粒，我一直在找pACYC质粒，但一直没找到，不知道LZ可不可以分享一下，我这里有pTrc99a、pET28a质粒，可以交换···
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···
8楼2014-10-20 10:39:04
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小冀- at 2014-10-20 10:39:04
LZ你好，我最近在做膜蛋白表达，需要一种低拷贝质粒，我一直在找pACYC质粒，但一直没找到，不知道LZ可不可以分享一下，我这里有pTrc99a、pET28a质粒，可以交换···

可以啊，不过你这两种蛮便宜的。你还有别的载体吗？
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9楼2014-10-20 19:58:42
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
9楼: Originally posted by charles08 at 2014-10-20 19:58:42
可以啊，不过你这两种蛮便宜的。你还有别的载体吗？...

不知道pACYC-Duet可不可以···
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···
10楼2014-10-20 21:57:33
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