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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 空质粒双酶切后出现消失的情况 已有1人参与

我是试剂盒抽提的质粒
空质粒双酶切后出现消失的情况。
另外,我将空载体PACYC电泳后产物回收放置3天也存在带变弱或者消失的情况
所以后续连接怎么无果

不知怎么解决的 。谢谢各位帮助一下
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tongyanna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
charles08(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-13 10:07:57
我们都是酶切完就直接做连接了,最多放置过一夜,还没有放几天再用的

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

自己的路,自己快乐的走
2楼2013-05-07 18:46:19
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by tongyanna at 2013-05-07 18:46:19
我们都是酶切完就直接做连接了,最多放置过一夜,还没有放几天再用的

今天刚做的结果,按标准体系配置酶切体系,
酶切5小时后立即连接过夜,仍然是没有连接上

只看见目的基因片段,没有载体质粒出现

不知何原因?


另外,空载体PACYC质粒电泳后回收后产物也存在降解的问题,三天后即不见带,远不及PCR产物耐储存。不知何原因,怎么解释??
不知该如何处置??
3楼2013-05-07 21:29:56
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by tongyanna at 2013-05-07 18:46:19
我们都是酶切完就直接做连接了,最多放置过一夜,还没有放几天再用的

今天是刚刚提取的质粒就进行酶切,酶切产物先65度灭活15分钟,再纯化回收,再开始连接。电泳结果是载体、目的DNA酶切产物均无带(降解了吧),连接产物也无条带
4楼2013-05-12 23:35:13
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rainlark

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

5楼2013-05-20 13:22:52
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by rainlark at 2013-05-20 13:22:52
楼主找到原因了吗?我在做实验的时候也遇到了楼主类似的事件

按楼上一位说的直接连接,加大剂量能连上,但是最近又连不上了
带模糊的不行,回收后根本见不了带
6楼2013-05-21 16:45:12
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by tongyanna at 2013-05-07 18:46:19
我们都是酶切完就直接做连接了,最多放置过一夜,还没有放几天再用的

请问你们用来酶切和连接的体系一般是多大的?

我现在双酶切一般没问题,就是连接产物时隐时现。
回收后根本没有带了根本不要说后期操作

我后面要再连一个基因,这没法往下做了
7楼2013-05-21 16:47:29
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

LZ你好,我最近在做膜蛋白表达,需要一种低拷贝质粒,我一直在找pACYC质粒,但一直没找到,不知道LZ可不可以分享一下,我这里有pTrc99a、pET28a质粒,可以交换···
···
8楼2014-10-20 10:39:04
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 小冀- at 2014-10-20 10:39:04
LZ你好,我最近在做膜蛋白表达,需要一种低拷贝质粒,我一直在找pACYC质粒,但一直没找到,不知道LZ可不可以分享一下,我这里有pTrc99a、pET28a质粒,可以交换···

可以啊,不过你这两种蛮便宜的。你还有别的载体吗?
9楼2014-10-20 19:58:42
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

引用回帖:
9楼: Originally posted by charles08 at 2014-10-20 19:58:42
可以啊,不过你这两种蛮便宜的。你还有别的载体吗?...

不知道pACYC-Duet可不可以···
···
10楼2014-10-20 21:57:33
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