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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET-22b构建好了质粒，表达不出来？
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chenxiang29

银虫 (正式写手)

[求助] pET-22b构建好了质粒，表达不出来？

构建好了之后IPTG诱导不成功，翻开以前跑的电泳图，感觉构建好的重组质粒大小理论上是6000bp左右，当然是超螺旋，但是电泳却是3000bp多，附图1（M,重组质粒1,2，pET-22b）,不知道各位虫友出现过这种问题么，酶切后是在5000以上，附图2(只看line3 为双酶切，line 5为 pet22b双酶切)
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smile to the world
1楼 2013-04-29 21:58:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chenxiang29(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-30 14:04:02
构建的质粒是否测序？
一般盒子提的质粒绝大部分是超螺旋构象，看质粒大小需要做单酶切成线状才能与marker比。
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2楼2013-04-30 11:46:40
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chenxiang29

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-30 11:46:40
构建的质粒是否测序？
一般盒子提的质粒绝大部分是超螺旋构象，看质粒大小需要做单酶切成线状才能与marker比。

已经测序正确，就是怕质粒其他的位置少了一段什么的。图2是双酶切，是在5000以上，与空质粒双酶切一致
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smile to the world
3楼2013-04-30 12:40:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by chenxiang29 at 2013-04-30 12:40:38
已经测序正确，就是怕质粒其他的位置少了一段什么的。图2是双酶切，是在5000以上，与空质粒双酶切一致...

如果怀疑载体本身有问题，实验室其他人是否也用这个载体，他们做的蛋白是否诱导表达成功了？当然，你也可以根据质粒序列和图谱设计引物，对载体的重要部分测序。
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4楼2013-05-01 03:00:05
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1<br>chenxiang29: 金币+5, <font color=red>★★★</font>很有帮助 <font color="gray">2013-05-01 11:11:23</font>
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-05-01 12:06:34
蛋白表达不成功有很多原因,在排除基因序列问题之外一般有以下原因:
1 目的基因来源,特别对来在于真核生物的蛋白,在原核生物中表达一般需要看看稀有密码子之类的东西,如果存在大量连续的稀有密码子,则一般表达不成功
2 你所谓的表达不成功是看的总蛋白还是纯化蛋白,需要对表达细胞的总蛋白,可溶蛋白和不溶蛋白最好跑胶时候有非诱导的样品进行对照
3 最后就是宿主细胞了,有时候不同的宿主细胞也会影响蛋白表达,常用的有BL21, Rosseta, gammi,什么之类的DE3菌
蛋白表达问题很多的，如果可以做个WB确定一下，是蛋白不能表达还是表达量低。
希望对你有用！
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5楼2013-05-01 10:31:56
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chenxiang29

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-05-01 10:31:56
蛋白表达不成功有很多原因,在排除基因序列问题之外一般有以下原因:
1 目的基因来源,特别对来在于真核生物的蛋白,在原核生物中表达一般需要看看稀有密码子之类的东西,如果存在大量连续的稀有密码子,则一般表达不成功 ...

我确实表达的是真核生物蛋白，但是500bp的基因大概只有5个稀有密码子，且不连续，您说这有必要试试rosseta吗
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smile to the world
6楼2013-05-01 10:40:57
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-01 12:06:45
这么小的基因应该还好！你试试换换细胞吧！有时候会有用的！我如果遇到这样的情况我就是讲这个目的基因重新克隆到一个新的backbon。有时候说不好，就是载体原件在出现问题！
祝你好运！
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7楼2013-05-01 10:55:34
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

楼主有此质粒的质粒图谱吗？给我发一个好吗
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
8楼2013-05-30 21:17:48
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