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chenxiang29

银虫 (正式写手)

[求助] pET-22b构建好了质粒,表达不出来?

构建好了之后IPTG诱导不成功,翻开以前跑的电泳图,感觉构建好的重组质粒大小理论上是6000bp左右,当然是超螺旋,但是电泳却是3000bp多,附图1(M,重组质粒1,2,pET-22b),不知道各位虫友出现过这种问题么,酶切后是在5000以上,附图2(只看line3 为双酶切,line 5为 pet22b双酶切)

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smile to the world
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-01 12:06:45
这么小的基因应该还好!你试试换换细胞吧!有时候会有用的!我如果遇到这样的情况我就是讲这个目的基因重新克隆到一个新的backbon。有时候说不好,就是载体原件在出现问题!
祝你好运!
7楼2013-05-01 10:55:34
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
chenxiang29(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-04-30 14:04:02
构建的质粒是否测序?
一般盒子提的质粒绝大部分是超螺旋构象,看质粒大小需要做单酶切成线状才能与marker比。
2楼2013-04-30 11:46:40
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chenxiang29

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-30 11:46:40
构建的质粒是否测序?
一般盒子提的质粒绝大部分是超螺旋构象,看质粒大小需要做单酶切成线状才能与marker比。

已经测序正确,就是怕质粒其他的位置少了一段什么的。图2是双酶切,是在5000以上,与空质粒双酶切一致
smile to the world
3楼2013-04-30 12:40:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by chenxiang29 at 2013-04-30 12:40:38
已经测序正确,就是怕质粒其他的位置少了一段什么的。图2是双酶切,是在5000以上,与空质粒双酶切一致...

如果怀疑载体本身有问题,实验室其他人是否也用这个载体,他们做的蛋白是否诱导表达成功了?当然,你也可以根据质粒序列和图谱设计引物,对载体的重要部分测序。
4楼2013-05-01 03:00:05
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