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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性
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liuwhlong

铁虫 (初入文坛)

[求助] 载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性 已有5人参与

各位前辈好，本人研一，进入实验室将近一年，最近构建真核表达载体5个，从细胞内trizol法提取总RNA，反转录产物作为模板，用5队特异性引物均能扩出目的片段，胶回收，回收产物琼脂糖电泳检测，双酶切，连接20小时，转化，挑菌各12个，于1.5ml EP管内加入500ul LB，摇混，行菌液PCR，电泳结果均为引物二聚体，反复做了多次，都是这样，第四次的时候出了几个阳性的，测序又显示全突变，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德莱的 MIX，最后用LA酶扩，测序仍然有突变，关键是，模板是细胞内提取的RNA反转录得到的，怎么会有突变？求指点，谢谢
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1楼 2014-04-30 23:53:08
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-03 20:33:19
第一点，不明白你说的全突变是什么意思，是突变了一个碱基？还是说插入的片段根本就不是你想要的；
第二点，其实你用到的2个酶应该都是Taq类型的，LA别以为是个好东西，你在扩增长片段时有时候确实是能够PCR出来，但是保真就一般般了，所以我从来不用这些玩意，除了他们的BUFF；
第三点，突变不一定就是PCR产生的，因为有可能你的模板就已经是突变了，你说的突变肯定是跟你想要的标准序列有出入，没准会是SNP
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7楼2014-05-03 13:47:58
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuwhlong(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:44:42
700bp目的片段不算大，不知道你的全突变是什么意思，是保真性太差还是非目的片段，cDNA没问题的话，建议考虑下rna模板本身的问题

[ 发自小木虫客户端 ]
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只有不断地失败才会成功
2楼2014-05-01 00:30:48
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-05-01 22:32:25
实在不行   就买那种高保真的酶试试   比如KOD   还有一个P开头的
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3楼2014-05-01 09:38:55
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuwhlong(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:44:50
一般情况下700bp的序列很少突变的，你的突变几率这么高，可能是实验出了问题。另一种情况是基因确实因为某种原因突变了，要是这种突变还有某种表型，那就好好好分析一下，大文章就是这么发出来的！
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4楼2014-05-01 11:25:26
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