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liuwhlong

铁虫 (初入文坛)

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专业: 口腔颌面疾病其他科学问题

[求助] 载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性已有5人参与

各位前辈好，本人研一，进入实验室将近一年，最近构建真核表达载体5个，从细胞内trizol法提取总RNA，反转录产物作为模板，用5队特异性引物均能扩出目的片段，胶回收，回收产物琼脂糖电泳检测，双酶切，连接20小时，转化，挑菌各12个，于1.5ml EP管内加入500ul LB，摇混，行菌液PCR，电泳结果均为引物二聚体，反复做了多次，都是这样，第四次的时候出了几个阳性的，测序又显示全突变，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德莱的 MIX，最后用LA酶扩，测序仍然有突变，关键是，模板是细胞内提取的RNA反转录得到的，怎么会有突变？求指点，谢谢

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1楼 2014-04-30 23:53:08

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金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-03 20:33:19

第一点，不明白你说的全突变是什么意思，是突变了一个碱基？还是说插入的片段根本就不是你想要的；
第二点，其实你用到的2个酶应该都是Taq类型的，LA别以为是个好东西，你在扩增长片段时有时候确实是能够PCR出来，但是保真就一般般了，所以我从来不用这些玩意，除了他们的BUFF；
第三点，突变不一定就是PCR产生的，因为有可能你的模板就已经是突变了，你说的突变肯定是跟你想要的标准序列有出入，没准会是SNP