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山水88木虫 (正式写手)
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[求助]
Red重组老是不成功，求救
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| 用Red重组敲除基因，做了一个多月了，还是没有成功，前期是抗性基因片段PCR量低，后来换了酶解决了，转了pKD46之后的菌株诱导表达到OD0.6制备感受态转化PCR片段，过程应该都是比较常规的了，可是这么久就是不成功，请问有做过的指点一下，谢谢了，浪费不起时间了 |
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 生物科学 |
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反正我最开始用tet做过 后来觉得问题太多（你假的菌落是不是比正常的小？ BW25113长的很快的，菌落比dh5alpha也大很多） 直接换其他抗性了，Kan clora spec都不会长假的，就是clora可能选择压力略大，不过长出来的都是一定有抗性的，另外重组质粒用psim19效率比pkd46高差不多一个数量级（pBad其实是个比较烂的诱导promoter）。 Ara0.2%差不多是10mM还多了，06年有文章说这个略微有点高（其实高浓度的Ara对E coli有点毒性），不过这个和诱导时间有关，我是OD=0.1诱导后1hr的。 |
7楼2013-11-02 02:13:19
13楼2013-11-02 15:25:13
16楼2013-11-02 22:53:02
guohuayin
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【答案】应助回帖
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山水88: 金币+10 2013-11-03 17:44:04
山水88: 金币+10 2013-11-03 17:44:04
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这是我能想到的解决办法：我看你做的实验，不应该是抗生素失效的问题，不过四环素抗性确实不好用，你可以给朱老师索要其他抗性质粒做个对照试试，也许就做出来了。同时我建议你检查所用的所有的实验材料，重组质粒，包括菌株是否正确，我做重组时，都是一个一个材料核实，确保重组系统没有问题，有些问题是当时我自己都没有料想到的，觉得不应该出现的问题，但是就是出错了，（比如曾经碰到重组质粒出错，抗生素失效，而这些都是问题的关键）。总之，重组碰到的问题太多，细心才能解决所有的问题。 |
18楼2013-11-03 01:02:17
27楼2013-11-19 10:12:10
山水88
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http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582 我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。 |
2楼2013-11-01 20:29:45
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1、将PKD46化转到大肠杆菌中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：50转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入阿拉伯糖至终浓度0.2%,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞，10%甘油洗涤。 2、将打靶分子（Tet抗性）>100ng左右（同源臂50bp），2500V电转至感受态中，30度培养2h后，涂布于Tet抗性的LB平板，37度过夜培养。 你说的Tet避光才开始我不知道，但是同时做了DH5a的对照没有长出菌落，因此抗性是存在的或者说操作对其影响不是很大。然后PCR完后没有经过DpnI处理而是跑胶回收的，在长出的菌落里提质粒没有发现模板质粒的存在，因此这步也应该不是问题吧。导入的抗性基因片段之前是PCR量太少，后面换了酶回收以后取0.5ul就能够达到和Marker差不多的量度了，而且这样我还是大量回收然后共沉之后电转的。我能想到的就是这些了，谢谢！ |
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