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山水88

木虫 (正式写手)

[求助] Red重组老是不成功，求救

用Red重组敲除基因，做了一个多月了，还是没有成功，前期是抗性基因片段PCR量低，后来换了酶解决了，转了pKD46之后的菌株诱导表达到OD0.6制备感受态转化PCR片段，过程应该都是比较常规的了，可是这么久就是不成功，请问有做过的指点一下，谢谢了，浪费不起时间了
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1楼 2013-11-01 14:39:17
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-01 22:45:42
tet要避光'，你实验步骤至少要写清楚吧，不然问题多了

1、将PKD46化转到大肠杆菌中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：50转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入阿拉伯糖至终浓度0.2%,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞，10%甘油洗涤。
2、将打靶分子（Tet抗性）>100ng左右（同源臂50bp），2500V电转至感受态中，30度培养2h后，涂布于Tet抗性的LB平板，37度过夜培养。

你说的Tet避光才开始我不知道，但是同时做了DH5a的对照没有长出菌落，因此抗性是存在的或者说操作对其影响不是很大。然后PCR完后没有经过DpnI处理而是跑胶回收的，在长出的菌落里提质粒没有发现模板质粒的存在，因此这步也应该不是问题吧。导入的抗性基因片段之前是PCR量太少，后面换了酶回收以后取0.5ul就能够达到和Marker差不多的量度了，而且这样我还是大量回收然后共沉之后电转的。我能想到的就是这些了，谢谢！
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6楼2013-11-02 00:05:54
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guohuayin

木虫 (著名写手)

博士，副教授

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。
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内生菌资源和核酸分子的利用
2楼2013-11-01 20:29:45
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guohuayin at 2013-11-01 20:29:45
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。

你好，看过您的帖子了，对您的工作表示惊喜。我目前的情况是抗性基因PCR片段量应该够了，感受态也是按照文献方法做的，菌株就是常用的BW25113，引物设计50+20bp，转化后在抗性平板上长的挺多的，但全是假阳性，因此想请教一下有什么需要注意或者可能会影响重组效率的步骤，谢谢！
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3楼2013-11-01 21:09:04
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guohuayin at 2013-11-01 20:29:45
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。

还有一个就是，我想敲除的是三个串联基因，大小在2.5kb，应该说也不是很大了，不知道这个会有影响么。另外一个就是我使用的是四环素抗性基因片段，以前这个抗生素也没用过，所以对它的使用注意事项也不是很清楚，如果是抗性失效的话，长出假阳性也就可以理解了，但同时我做DH5a对照是没有菌落长出来的，因此重组效率不高应该是主要问题了，当然，四环素使用注意事项也烦请老师指点一二，谢谢！
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4楼2013-11-01 21:17:33
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