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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因敲除不成功
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lifefly

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除不成功

做基因敲初时，当一段抗性基因电转进大肠杆菌后，出现抗性表型，但是PCR验证时发现没有敲除成功，这是什么原因啊？
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1楼 2012-11-26 16:12:43
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-11-26 20:22:04
首先带个阳性对照做PCR看看是不是PCR的问题，实在不行做southern blit，这个更加可信
如果阳性对照没问题的话就说明是假阳性，可以考虑提高下抗生素浓度什么的（顺便问下你是什么抗生素哦，有些抗生素容易出假阳性）~
做敲除的时候最好多挑点转化子都验证一下，就算有假的至少能挑到真的~
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2楼2012-11-26 17:37:25
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lifefly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-26 17:37:25
首先带个阳性对照做PCR看看是不是PCR的问题，实在不行做southern blit，这个更加可信
如果阳性对照没问题的话就说明是假阳性，可以考虑提高下抗生素浓度什么的（顺便问下你是什么抗生素哦，有些抗生素容易出假阳性 ...

我所用的抗生素是kan，目前验证下来的结果推断是基因片段电转进了细胞，但是没有敲入基因组，一般是不是做电转感受态时就加阿拉伯糖诱导，之后电转后用37度培养嘛？有没有可能是PKD46没能成功表达那三个促进同源重组的蛋白？
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3楼2012-11-28 09:55:14
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lifefly at 2012-11-28 09:55:14
我所用的抗生素是kan，目前验证下来的结果推断是基因片段电转进了细胞，但是没有敲入基因组，一般是不是做电转感受态时就加阿拉伯糖诱导，之后电转后用37度培养嘛？有没有可能是PKD46没能成功表达那三个促进同源重 ...

原来是做的red系统的敲除啊……那应该很好做才对哦……
没敲入的话就调整一下把同源臂长度弄长点呗~你整个500bp到1k的同源臂肯定没问题啊
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4楼2012-11-28 14:37:07
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lifefly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-28 14:37:07
原来是做的red系统的敲除啊……那应该很好做才对哦……
没敲入的话就调整一下把同源臂长度弄长点呗~你整个500bp到1k的同源臂肯定没问题啊...

我现在验证下来是发现我扩增目的基因时的模板也就是质粒一起转进了靶细胞中  这是怎么回事呀？
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5楼2012-11-29 09:10:49
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hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你扩增目的基因后不回收就直接电转吗？回收后应该就不会有模板质粒了。
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6楼2012-11-29 10:57:51
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by lifefly at 2012-11-29 09:10:49
我现在验证下来是发现我扩增目的基因时的模板也就是质粒一起转进了靶细胞中  这是怎么回事呀？...

话说，你做完PCR之后是切胶回收还是PCR回收的？如果你是PCR回收很有可能带进去了微量质粒，全给电转进了细胞了……
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7楼2012-11-29 19:45:50
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lifefly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-29 19:45:50
话说，你做完PCR之后是切胶回收还是PCR回收的？如果你是PCR回收很有可能带进去了微量质粒，全给电转进了细胞了……...

胶回收的  但是还带有少量的质粒好像，不过现在敲成功了
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8楼2012-12-03 13:05:51
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summermio

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lifefly at 2012-12-03 13:05:51
胶回收的  但是还带有少量的质粒好像，不过现在敲成功了...

我电转之后也长了很多菌落，验证了10来个全是假阳性。 请问楼主怎么检测的质粒污染？
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9楼2014-04-19 04:01:53
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748436536

新虫 (初入文坛)
lz   我也在做red重组系统，但是质粒PKD46消除时消除不掉，42度培养一般应该消除掉了  但我挑同一单菌落分别涂氯霉素和氨苄青霉素LB板，结果却是氨苄长了  氯霉素没长，求交流
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10楼2015-04-21 20:55:22
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