24小时热门版块排行榜    

查看: 3378  |  回复: 10

lifefly

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除不成功

做基因敲初时,当一段抗性基因电转进大肠杆菌后,出现抗性表型,但是PCR验证时发现没有敲除成功,这是什么原因啊?
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-11-26 20:22:04
首先带个阳性对照做PCR看看是不是PCR的问题,实在不行做southern blit,这个更加可信
如果阳性对照没问题的话就说明是假阳性,可以考虑提高下抗生素浓度什么的(顺便问下你是什么抗生素哦,有些抗生素容易出假阳性)~
做敲除的时候最好多挑点转化子都验证一下,就算有假的至少能挑到真的~
2楼2012-11-26 17:37:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefly

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-26 17:37:25
首先带个阳性对照做PCR看看是不是PCR的问题,实在不行做southern blit,这个更加可信
如果阳性对照没问题的话就说明是假阳性,可以考虑提高下抗生素浓度什么的(顺便问下你是什么抗生素哦,有些抗生素容易出假阳性 ...

我所用的抗生素是kan,目前验证下来的结果推断是基因片段电转进了细胞,但是没有敲入基因组,一般是不是做电转感受态时就加阿拉伯糖诱导,之后电转后用37度培养嘛?有没有可能是PKD46没能成功表达那三个促进同源重组的蛋白?
3楼2012-11-28 09:55:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lifefly at 2012-11-28 09:55:14
我所用的抗生素是kan,目前验证下来的结果推断是基因片段电转进了细胞,但是没有敲入基因组,一般是不是做电转感受态时就加阿拉伯糖诱导,之后电转后用37度培养嘛?有没有可能是PKD46没能成功表达那三个促进同源重 ...

原来是做的red系统的敲除啊……那应该很好做才对哦……
没敲入的话就调整一下把同源臂长度弄长点呗~你整个500bp到1k的同源臂肯定没问题啊
4楼2012-11-28 14:37:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefly

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-28 14:37:07
原来是做的red系统的敲除啊……那应该很好做才对哦……
没敲入的话就调整一下把同源臂长度弄长点呗~你整个500bp到1k的同源臂肯定没问题啊...

我现在验证下来是发现我扩增目的基因时的模板也就是质粒一起转进了靶细胞中  这是怎么回事呀?
5楼2012-11-29 09:10:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你扩增目的基因后不回收就直接电转吗?回收后应该就不会有模板质粒了。
6楼2012-11-29 10:57:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by lifefly at 2012-11-29 09:10:49
我现在验证下来是发现我扩增目的基因时的模板也就是质粒一起转进了靶细胞中  这是怎么回事呀?...

话说,你做完PCR之后是切胶回收还是PCR回收的?如果你是PCR回收很有可能带进去了微量质粒,全给电转进了细胞了……
7楼2012-11-29 19:45:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefly

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-29 19:45:50
话说,你做完PCR之后是切胶回收还是PCR回收的?如果你是PCR回收很有可能带进去了微量质粒,全给电转进了细胞了……...

胶回收的  但是还带有少量的质粒好像,不过现在敲成功了
8楼2012-12-03 13:05:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

summermio

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by lifefly at 2012-12-03 13:05:51
胶回收的  但是还带有少量的质粒好像,不过现在敲成功了...

我电转之后也长了很多菌落,验证了10来个全是假阳性。 请问楼主怎么检测的质粒污染?
9楼2014-04-19 04:01:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

748436536

新虫 (初入文坛)

lz   我也在做red重组系统,但是质粒PKD46消除时消除不掉,42度培养一般应该消除掉了  但我挑同一单菌落分别涂氯霉素和氨苄青霉素LB板,结果却是氨苄长了  氯霉素没长,求交流
10楼2015-04-21 20:55:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lifefly 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +4 angus9576 2026-08-17 8/400 2026-08-17 17:26 by angus9576
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +8 wangze12014 2026-08-14 10/500 2026-08-17 17:05 by xter9665
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +34 医学老男孩 2026-08-13 81/4050 2026-08-17 16:20 by yudaoqian88
[基金申请] 时间戳变了,能看出什么问题? +4 基诺咪客 2026-08-17 4/200 2026-08-17 16:10 by Vivilian
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜? +12 Ldrop2023 2026-08-13 15/750 2026-08-17 15:02 by 小豌豆_发芽
[基金申请] 今天系统多次维护,明天很可能放榜! +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 6/300 2026-08-16 20:07 by 奶牛小黑
[基金申请] 快农历七夕节了,轻松一下,男人悄悄话,女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 有时候,自然基金真的不能太认真 (我的申报经验) +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液,抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友,我要去昆明玩几天,回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 重要来源:本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能,周易传统文化,filecode打分制来了,3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见,大家看看几个A,几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 什么时候出结果,有咨询渠道??? +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
信息提示
请填处理意见