24小时热门版块排行榜    

查看: 3409  |  回复: 10
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

lifefly

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除不成功

做基因敲初时,当一段抗性基因电转进大肠杆菌后,出现抗性表型,但是PCR验证时发现没有敲除成功,这是什么原因啊?
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefly

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-28 14:37:07
原来是做的red系统的敲除啊……那应该很好做才对哦……
没敲入的话就调整一下把同源臂长度弄长点呗~你整个500bp到1k的同源臂肯定没问题啊...

我现在验证下来是发现我扩增目的基因时的模板也就是质粒一起转进了靶细胞中  这是怎么回事呀?
5楼2012-11-29 09:10:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-11-26 20:22:04
首先带个阳性对照做PCR看看是不是PCR的问题,实在不行做southern blit,这个更加可信
如果阳性对照没问题的话就说明是假阳性,可以考虑提高下抗生素浓度什么的(顺便问下你是什么抗生素哦,有些抗生素容易出假阳性)~
做敲除的时候最好多挑点转化子都验证一下,就算有假的至少能挑到真的~
2楼2012-11-26 17:37:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifefly

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-26 17:37:25
首先带个阳性对照做PCR看看是不是PCR的问题,实在不行做southern blit,这个更加可信
如果阳性对照没问题的话就说明是假阳性,可以考虑提高下抗生素浓度什么的(顺便问下你是什么抗生素哦,有些抗生素容易出假阳性 ...

我所用的抗生素是kan,目前验证下来的结果推断是基因片段电转进了细胞,但是没有敲入基因组,一般是不是做电转感受态时就加阿拉伯糖诱导,之后电转后用37度培养嘛?有没有可能是PKD46没能成功表达那三个促进同源重组的蛋白?
3楼2012-11-28 09:55:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lifefly at 2012-11-28 09:55:14
我所用的抗生素是kan,目前验证下来的结果推断是基因片段电转进了细胞,但是没有敲入基因组,一般是不是做电转感受态时就加阿拉伯糖诱导,之后电转后用37度培养嘛?有没有可能是PKD46没能成功表达那三个促进同源重 ...

原来是做的red系统的敲除啊……那应该很好做才对哦……
没敲入的话就调整一下把同源臂长度弄长点呗~你整个500bp到1k的同源臂肯定没问题啊
4楼2012-11-28 14:37:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 要骂人了,新模版改版就是要淡化问题凝练这种虚的东西,结果有个评委还在说凝练得不够 +9 瞬息宇宙 2026-08-31 17/850 2026-09-02 14:04 by anjeeshine
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 10/500 2026-09-02 11:35 by 大不刘6
[基金申请] 学科评审组评审是指会评吗? +5 瞬息宇宙 2026-08-31 5/250 2026-09-02 10:13 by 雨冰共舞
[文学芳草园] 梦想 +5 myrtle 2026-08-26 8/400 2026-09-02 02:42 by Leogzhya
[基金申请] 面上合作单位盖章 +6 ssyjh 2026-08-27 9/450 2026-09-01 20:01 by huagongfeihu
[基金申请] 面上函评意见出来了,像什么等级? 20+4 Tsingking1 2026-08-27 17/850 2026-09-01 19:51 by 超级无敌华子
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高,自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[论文投稿] 小白求助 投论文要求的highlights应该如何写 5+3 l1963982152 2026-08-29 4/200 2026-09-01 09:04 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见(F口面上) +7 gdd2018 2026-08-28 12/600 2026-09-01 08:32 by 尼古拉斯小虫
[基金申请] 国社科又开始会评了,不知道这次命运如何 +7 雨打竹帘 2026-08-30 11/550 2026-08-31 23:16 by hittle2008
[基金申请] 基金未中,这种答复是模板吗? +6 zhaosm1982 2026-08-27 7/350 2026-08-31 21:18 by qdxxmc
[基金申请] 面上意见出来了 +12 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 23/1150 2026-08-31 18:57 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 能否申诉? +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗? +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 为什么到现在没收到通知? +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 看板上这么多中的,有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
信息提示
请填处理意见