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汕头大学海洋科学接受调剂
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bonbonzd

木虫 (小有名气)

[交流] 基因敲入,同源重组 已有3人参与

大家好,最近接触同源重组,想把一段基因,利用在同源重组技术,将其插入到受体菌染色体中。有一些疑惑的地方,还望高手赐教。
1,构建同源重组打靶载体,有什么要求,必须要以自杀性质粒为骨架吗?
2,我要插入的基因片段为4Kb多,对于这么大的片段,同源重组技术能实现吗?
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bonbonzd

木虫 (小有名气)

还有可不可以不构建打靶载体,直接将含有插入位点同源序列的目的基因片段,转到受体细胞内,完成同源重组,基因敲入
2楼2012-08-04 17:19:38
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robert-RBT

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
可以不用构建载体,直接用同源序列和筛选标记导入菌株。4kb应该没有问题。真菌中还有更大想序列也成功的。一般同源序适当延长,有助于基因敲除。
3楼2012-08-04 21:10:39
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bonbonzd

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-04 21:10:39
可以不用构建载体,直接用同源序列和筛选标记导入菌株。4kb应该没有问题。真菌中还有更大想序列也成功的。一般同源序适当延长,有助于基因敲除。

谢谢!我做的是基因敲入,是同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样的一个片段导入细胞吗?
4楼2012-08-04 23:50:55
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robert-RBT

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by bonbonzd at 2012-08-04 23:50:55
谢谢!我做的是基因敲入,是同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样的一个片段导入细胞吗?...

可以,除了有致死效应的序列外,理论上可以在任何位置导入目的序列。
5楼2012-08-05 01:15:34
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xbl3688

银虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-07 15:49:31
你所谓的自杀质粒应该是在受体菌株不能复制,但是在构建菌株内可以复制的吧,这样是可以的。
另外,同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样构建理论上是可以的,但是你要多少个合适的酶切位点啊,到时候一个切不好,头都炸了。筛选标记可以考虑去掉
生活的乐趣在于善于发现美,学会欣赏美
6楼2012-08-07 15:31:58
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bonbonzd

木虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by xbl3688 at 2012-08-07 15:31:58
你所谓的自杀质粒应该是在受体菌株不能复制,但是在构建菌株内可以复制的吧,这样是可以的。
另外,同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样构建理论上是可以的,但是你要多少个合适的酶切位点啊,到时候一个切不 ...

谢谢你的解答,可是如果不加入筛选标记,怎么去鉴别同源重组成功?还有我想利用双交换,第一次将外源目的基因和抗性标记等序列都插入受体菌染色体,然后第二次交换把抗性基因等在脱落只留下外源目的基因,那么只是将同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样的一个片段导入细胞是不是不可以啊?是不是必须要构建包含同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样片段的载体,才能实现我的目的啊?筛选标记打算用抗生素和sacB正负筛选标记。问题有点多,谢谢
7楼2012-08-08 00:09:02
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xbl3688

银虫 (正式写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-08 14:28:42
引用回帖:
7楼: Originally posted by bonbonzd at 2012-08-08 00:09:02
谢谢你的解答,可是如果不加入筛选标记,怎么去鉴别同源重组成功?还有我想利用双交换,第一次将外源目的基因和抗性标记等序列都插入受体菌染色体,然后第二次交换把抗性基因等在脱落只留下外源目的基因,那么只是 ...

同源交换是概率事件,是在传代过程中发生的。只导入片段成功率应该很低,还是考虑转重组质粒吧。
    假设是“同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列”这样的序列重组到了染色体上,如果质粒不能缺失,用抗生素筛选到的就不知是真是假了。 只是个人想法。好运!

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生活的乐趣在于善于发现美,学会欣赏美
8楼2012-08-08 10:18:51
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bonbonzd

木虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by xbl3688 at 2012-08-08 10:18:51
同源交换是概率事件,是在传代过程中发生的。只导入片段成功率应该很低,还是考虑转重组质粒吧。
    假设是“同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列”这样的序列重组到了染色体上,如果质粒不能缺失,用抗生素筛选 ...

谢谢,你的回答
9楼2012-08-08 21:12:51
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serena1205

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by xbl3688 at 2012-08-07 15:31:58
你所谓的自杀质粒应该是在受体菌株不能复制,但是在构建菌株内可以复制的吧,这样是可以的。
另外,同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样构建理论上是可以的,但是你要多少个合适的酶切位点啊,到时候一个切不 ...

筛选标记要怎么去掉啊
10楼2013-03-15 22:38:57
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