应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因敲入，同源重组
111/2返回列表12下一页
查看: 4256  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

bonbonzd

木虫 (小有名气)

[交流] 基因敲入，同源重组 已有3人参与

大家好，最近接触同源重组，想把一段基因，利用在同源重组技术，将其插入到受体菌染色体中。有一些疑惑的地方，还望高手赐教。
1，构建同源重组打靶载体，有什么要求，必须要以自杀性质粒为骨架吗？
2，我要插入的基因片段为4Kb多，对于这么大的片段，同源重组技术能实现吗？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-08-04 16:49:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bonbonzd

木虫 (小有名气)
还有可不可以不构建打靶载体，直接将含有插入位点同源序列的目的基因片段，转到受体细胞内，完成同源重组，基因敲入
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-04 17:19:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以不用构建载体，直接用同源序列和筛选标记导入菌株。4kb应该没有问题。真菌中还有更大想序列也成功的。一般同源序适当延长，有助于基因敲除。
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-04 21:10:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bonbonzd

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-04 21:10:39
可以不用构建载体，直接用同源序列和筛选标记导入菌株。4kb应该没有问题。真菌中还有更大想序列也成功的。一般同源序适当延长，有助于基因敲除。

谢谢！我做的是基因敲入，是同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样的一个片段导入细胞吗？
赞一下 回复此楼
4楼2012-08-04 23:50:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by bonbonzd at 2012-08-04 23:50:55
谢谢！我做的是基因敲入，是同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样的一个片段导入细胞吗？...

可以，除了有致死效应的序列外，理论上可以在任何位置导入目的序列。
赞一下 回复此楼
5楼2012-08-05 01:15:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xbl3688

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-07 15:49:31
你所谓的自杀质粒应该是在受体菌株不能复制，但是在构建菌株内可以复制的吧，这样是可以的。
另外，同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样构建理论上是可以的，但是你要多少个合适的酶切位点啊，到时候一个切不好，头都炸了。筛选标记可以考虑去掉
赞一下 回复此楼
生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
6楼2012-08-07 15:31:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bonbonzd

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xbl3688 at 2012-08-07 15:31:58
你所谓的自杀质粒应该是在受体菌株不能复制，但是在构建菌株内可以复制的吧，这样是可以的。
另外，同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样构建理论上是可以的，但是你要多少个合适的酶切位点啊，到时候一个切不 ...

谢谢你的解答，可是如果不加入筛选标记，怎么去鉴别同源重组成功？还有我想利用双交换，第一次将外源目的基因和抗性标记等序列都插入受体菌染色体，然后第二次交换把抗性基因等在脱落只留下外源目的基因，那么只是将同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样的一个片段导入细胞是不是不可以啊？是不是必须要构建包含同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样片段的载体，才能实现我的目的啊？筛选标记打算用抗生素和sacB正负筛选标记。问题有点多，谢谢
赞一下 回复此楼
7楼2012-08-08 00:09:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xbl3688

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-08 14:28:42
引用回帖:
7楼: Originally posted by bonbonzd at 2012-08-08 00:09:02
谢谢你的解答，可是如果不加入筛选标记，怎么去鉴别同源重组成功？还有我想利用双交换，第一次将外源目的基因和抗性标记等序列都插入受体菌染色体，然后第二次交换把抗性基因等在脱落只留下外源目的基因，那么只是 ...

同源交换是概率事件，是在传代过程中发生的。只导入片段成功率应该很低，还是考虑转重组质粒吧。
    假设是“同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列”这样的序列重组到了染色体上，如果质粒不能缺失，用抗生素筛选到的就不知是真是假了。 只是个人想法。好运！
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

bonbonzd
生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
8楼2012-08-08 10:18:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bonbonzd

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by xbl3688 at 2012-08-08 10:18:51
同源交换是概率事件，是在传代过程中发生的。只导入片段成功率应该很低，还是考虑转重组质粒吧。
    假设是“同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列”这样的序列重组到了染色体上，如果质粒不能缺失，用抗生素筛选 ...

谢谢，你的回答
回复此楼
9楼2012-08-08 21:12:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

serena1205

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by xbl3688 at 2012-08-07 15:31:58
你所谓的自杀质粒应该是在受体菌株不能复制，但是在构建菌株内可以复制的吧，这样是可以的。
另外，同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样构建理论上是可以的，但是你要多少个合适的酶切位点啊，到时候一个切不 ...

筛选标记要怎么去掉啊
赞一下 回复此楼
10楼2013-03-15 22:38:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 bonbonzd 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭