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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因敲入，同源重组
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bonbonzd

木虫 (小有名气)

[交流] 基因敲入，同源重组已有3人参与

大家好，最近接触同源重组，想把一段基因，利用在同源重组技术，将其插入到受体菌染色体中。有一些疑惑的地方，还望高手赐教。
1，构建同源重组打靶载体，有什么要求，必须要以自杀性质粒为骨架吗？
2，我要插入的基因片段为4Kb多，对于这么大的片段，同源重组技术能实现吗？
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1楼2012-08-04 16:49:27
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bonbonzd

木虫 (小有名气)
还有可不可以不构建打靶载体，直接将含有插入位点同源序列的目的基因片段，转到受体细胞内，完成同源重组，基因敲入
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2楼2012-08-04 17:19:38
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robert-RBT

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以不用构建载体，直接用同源序列和筛选标记导入菌株。4kb应该没有问题。真菌中还有更大想序列也成功的。一般同源序适当延长，有助于基因敲除。
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3楼2012-08-04 21:10:39
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bonbonzd

木虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-04 21:10:39
可以不用构建载体，直接用同源序列和筛选标记导入菌株。4kb应该没有问题。真菌中还有更大想序列也成功的。一般同源序适当延长，有助于基因敲除。

谢谢！我做的是基因敲入，是同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样的一个片段导入细胞吗？
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4楼2012-08-04 23:50:55
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robert-RBT

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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4楼: Originally posted by bonbonzd at 2012-08-04 23:50:55
谢谢！我做的是基因敲入，是同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样的一个片段导入细胞吗？...

可以，除了有致死效应的序列外，理论上可以在任何位置导入目的序列。
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5楼2012-08-05 01:15:34
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xbl3688

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-07 15:49:31
你所谓的自杀质粒应该是在受体菌株不能复制，但是在构建菌株内可以复制的吧，这样是可以的。
另外，同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样构建理论上是可以的，但是你要多少个合适的酶切位点啊，到时候一个切不好，头都炸了。筛选标记可以考虑去掉
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
6楼2012-08-07 15:31:58
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bonbonzd

木虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by xbl3688 at 2012-08-07 15:31:58
你所谓的自杀质粒应该是在受体菌株不能复制，但是在构建菌株内可以复制的吧，这样是可以的。
另外，同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样构建理论上是可以的，但是你要多少个合适的酶切位点啊，到时候一个切不 ...

谢谢你的解答，可是如果不加入筛选标记，怎么去鉴别同源重组成功？还有我想利用双交换，第一次将外源目的基因和抗性标记等序列都插入受体菌染色体，然后第二次交换把抗性基因等在脱落只留下外源目的基因，那么只是将同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样的一个片段导入细胞是不是不可以啊？是不是必须要构建包含同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样片段的载体，才能实现我的目的啊？筛选标记打算用抗生素和sacB正负筛选标记。问题有点多，谢谢
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7楼2012-08-08 00:09:02
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xbl3688

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-08 14:28:42
引用回帖:
7楼: Originally posted by bonbonzd at 2012-08-08 00:09:02
谢谢你的解答，可是如果不加入筛选标记，怎么去鉴别同源重组成功？还有我想利用双交换，第一次将外源目的基因和抗性标记等序列都插入受体菌染色体，然后第二次交换把抗性基因等在脱落只留下外源目的基因，那么只是 ...

同源交换是概率事件，是在传代过程中发生的。只导入片段成功率应该很低，还是考虑转重组质粒吧。
    假设是“同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列”这样的序列重组到了染色体上，如果质粒不能缺失，用抗生素筛选到的就不知是真是假了。 只是个人想法。好运！
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bonbonzd
生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
8楼2012-08-08 10:18:51
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bonbonzd

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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8楼: Originally posted by xbl3688 at 2012-08-08 10:18:51
同源交换是概率事件，是在传代过程中发生的。只导入片段成功率应该很低，还是考虑转重组质粒吧。
    假设是“同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列”这样的序列重组到了染色体上，如果质粒不能缺失，用抗生素筛选 ...

谢谢，你的回答
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9楼2012-08-08 21:12:51
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serena1205

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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6楼: Originally posted by xbl3688 at 2012-08-07 15:31:58
你所谓的自杀质粒应该是在受体菌株不能复制，但是在构建菌株内可以复制的吧，这样是可以的。
另外，同源序列-目的基因-筛选标记-同源序列这样构建理论上是可以的，但是你要多少个合适的酶切位点啊，到时候一个切不 ...

筛选标记要怎么去掉啊
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10楼2013-03-15 22:38:57
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