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lifefly

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除不成功

做基因敲初时,当一段抗性基因电转进大肠杆菌后,出现抗性表型,但是PCR验证时发现没有敲除成功,这是什么原因啊?
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summermio

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by lifefly at 2012-12-03 13:05:51
胶回收的  但是还带有少量的质粒好像,不过现在敲成功了...

我电转之后也长了很多菌落,验证了10来个全是假阳性。 请问楼主怎么检测的质粒污染?
9楼2014-04-19 04:01:53
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-11-26 20:22:04
首先带个阳性对照做PCR看看是不是PCR的问题,实在不行做southern blit,这个更加可信
如果阳性对照没问题的话就说明是假阳性,可以考虑提高下抗生素浓度什么的(顺便问下你是什么抗生素哦,有些抗生素容易出假阳性)~
做敲除的时候最好多挑点转化子都验证一下,就算有假的至少能挑到真的~
2楼2012-11-26 17:37:25
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lifefly

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-26 17:37:25
首先带个阳性对照做PCR看看是不是PCR的问题,实在不行做southern blit,这个更加可信
如果阳性对照没问题的话就说明是假阳性,可以考虑提高下抗生素浓度什么的(顺便问下你是什么抗生素哦,有些抗生素容易出假阳性 ...

我所用的抗生素是kan,目前验证下来的结果推断是基因片段电转进了细胞,但是没有敲入基因组,一般是不是做电转感受态时就加阿拉伯糖诱导,之后电转后用37度培养嘛?有没有可能是PKD46没能成功表达那三个促进同源重组的蛋白?
3楼2012-11-28 09:55:14
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lifefly at 2012-11-28 09:55:14
我所用的抗生素是kan,目前验证下来的结果推断是基因片段电转进了细胞,但是没有敲入基因组,一般是不是做电转感受态时就加阿拉伯糖诱导,之后电转后用37度培养嘛?有没有可能是PKD46没能成功表达那三个促进同源重 ...

原来是做的red系统的敲除啊……那应该很好做才对哦……
没敲入的话就调整一下把同源臂长度弄长点呗~你整个500bp到1k的同源臂肯定没问题啊
4楼2012-11-28 14:37:07
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