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lifefly

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除不成功

做基因敲初时，当一段抗性基因电转进大肠杆菌后，出现抗性表型，但是PCR验证时发现没有敲除成功，这是什么原因啊？
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1楼2012-11-26 16:12:43
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748436536

新虫 (初入文坛)
lz   我也在做red重组系统，但是质粒PKD46消除时消除不掉，42度培养一般应该消除掉了  但我挑同一单菌落分别涂氯霉素和氨苄青霉素LB板，结果却是氨苄长了  氯霉素没长，求交流
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10楼2015-04-21 20:55:22
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-11-26 20:22:04
首先带个阳性对照做PCR看看是不是PCR的问题，实在不行做southern blit，这个更加可信
如果阳性对照没问题的话就说明是假阳性，可以考虑提高下抗生素浓度什么的（顺便问下你是什么抗生素哦，有些抗生素容易出假阳性）~
做敲除的时候最好多挑点转化子都验证一下，就算有假的至少能挑到真的~
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2楼2012-11-26 17:37:25
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lifefly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-26 17:37:25
首先带个阳性对照做PCR看看是不是PCR的问题，实在不行做southern blit，这个更加可信
如果阳性对照没问题的话就说明是假阳性，可以考虑提高下抗生素浓度什么的（顺便问下你是什么抗生素哦，有些抗生素容易出假阳性 ...

我所用的抗生素是kan，目前验证下来的结果推断是基因片段电转进了细胞，但是没有敲入基因组，一般是不是做电转感受态时就加阿拉伯糖诱导，之后电转后用37度培养嘛？有没有可能是PKD46没能成功表达那三个促进同源重组的蛋白？
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3楼2012-11-28 09:55:14
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lifefly at 2012-11-28 09:55:14
我所用的抗生素是kan，目前验证下来的结果推断是基因片段电转进了细胞，但是没有敲入基因组，一般是不是做电转感受态时就加阿拉伯糖诱导，之后电转后用37度培养嘛？有没有可能是PKD46没能成功表达那三个促进同源重 ...

原来是做的red系统的敲除啊……那应该很好做才对哦……
没敲入的话就调整一下把同源臂长度弄长点呗~你整个500bp到1k的同源臂肯定没问题啊
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4楼2012-11-28 14:37:07
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