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山水88木虫 (正式写手)
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[求助]
Red重组老是不成功，求救
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| 用Red重组敲除基因，做了一个多月了，还是没有成功，前期是抗性基因片段PCR量低，后来换了酶解决了，转了pKD46之后的菌株诱导表达到OD0.6制备感受态转化PCR片段，过程应该都是比较常规的了，可是这么久就是不成功，请问有做过的指点一下，谢谢了，浪费不起时间了 |
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 生物科学 |
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【答案】应助回帖
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反正我最开始用tet做过 后来觉得问题太多（你假的菌落是不是比正常的小？ BW25113长的很快的，菌落比dh5alpha也大很多） 直接换其他抗性了，Kan clora spec都不会长假的，就是clora可能选择压力略大，不过长出来的都是一定有抗性的，另外重组质粒用psim19效率比pkd46高差不多一个数量级（pBad其实是个比较烂的诱导promoter）。 Ara0.2%差不多是10mM还多了，06年有文章说这个略微有点高（其实高浓度的Ara对E coli有点毒性），不过这个和诱导时间有关，我是OD=0.1诱导后1hr的。 |
7楼2013-11-02 02:13:19
guohuayin
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【答案】应助回帖
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http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582 我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。 |
2楼2013-11-01 20:29:45
山水88
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3楼2013-11-01 21:09:04
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4楼2013-11-01 21:17:33