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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Red重组老是不成功，求救
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山水88

木虫 (正式写手)

[求助] Red重组老是不成功，求救

用Red重组敲除基因，做了一个多月了，还是没有成功，前期是抗性基因片段PCR量低，后来换了酶解决了，转了pKD46之后的菌株诱导表达到OD0.6制备感受态转化PCR片段，过程应该都是比较常规的了，可是这么久就是不成功，请问有做过的指点一下，谢谢了，浪费不起时间了
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1楼 2013-11-01 14:39:17
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
山水88: 金币+20 2013-11-03 17:43:17
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。从根本去入手 2013-11-04 08:35:42
山水88: 金币+15, 终于成功了，谢谢您的帮助！ 2013-12-09 21:50:22
反正我最开始用tet做过  后来觉得问题太多（你假的菌落是不是比正常的小？ BW25113长的很快的，菌落比dh5alpha也大很多）
直接换其他抗性了，Kan clora spec都不会长假的，就是clora可能选择压力略大，不过长出来的都是一定有抗性的，另外重组质粒用psim19效率比pkd46高差不多一个数量级（pBad其实是个比较烂的诱导promoter）。
Ara0.2%差不多是10mM还多了，06年有文章说这个略微有点高（其实高浓度的Ara对E coli有点毒性），不过这个和诱导时间有关，我是OD=0.1诱导后1hr的。
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7楼2013-11-02 02:13:19
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oaixlittle

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
山水88: 金币+5 2013-11-03 17:43:41
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-11-04 08:35:56
以前我们做这个转化效率不高，就是增加感受态和PCR片段的量，50ml菌体做一管感受态，PCR产物50或100ul沉淀到5ul直接全部转掉
假阳性多可能是你PCR的模板没弄好，一定不能有质粒混在里面。我们用的是pIJ773，一定要确保完全酶切，片段电泳后胶回收，处理成线性片段再去做模板
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13楼2013-11-02 15:25:13
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
上面同样重组说的是用本身RecA之类的重组吧，那个要求比red系统高不少。

另外lz你目标菌里面既然P不出tetR，那么只能是抗性失效/污染/奇怪的抗性。 反正我觉得既然有不带抗性的假阳性，最好就是换一种抗性。
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16楼2013-11-02 22:53:02
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guohuayin

木虫 (著名写手)

博士，副教授

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
山水88: 金币+10 2013-11-03 17:44:04
引用回帖:
6楼: Originally posted by 山水88 at 2013-11-01 04:05:54
1、将PKD46化转到大肠杆菌中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：50转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入阿拉伯糖至终浓度0.2%,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞 ...

这是我能想到的解决办法：我看你做的实验，不应该是抗生素失效的问题，不过四环素抗性确实不好用，你可以给朱老师索要其他抗性质粒做个对照试试，也许就做出来了。同时我建议你检查所用的所有的实验材料，重组质粒，包括菌株是否正确，我做重组时，都是一个一个材料核实，确保重组系统没有问题，有些问题是当时我自己都没有料想到的，觉得不应该出现的问题，但是就是出错了，（比如曾经碰到重组质粒出错，抗生素失效，而这些都是问题的关键）。总之，重组碰到的问题太多，细心才能解决所有的问题。
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内生菌资源和核酸分子的利用
18楼2013-11-03 01:02:17
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
你重组质粒是哪个（哪篇文献）？重组酶的启动子是什么？   red系统是对细胞有毒的，你至少应该等OD到0.1再开始诱导（如果是PL系的启动子，诱导20min左右就可以了），另外2mMIPTG已经对细胞有些毒性了，SOB我没用过，但是葡萄糖对整个细胞代谢（蛋白质合成）是有影响的，另外OD=0.6有点偏高，0.4左右比较好

另外最后一步我没试过30°带原始质粒过夜，不过我觉得这样总是给细胞增加压力。
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27楼2013-11-19 10:12:10
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-19 11:40:07
wtLAC promoter得话全程用LB培养基，Plac是Crp激活，LacI抑制，Crp是受cAMP（葡萄糖抑制）调控
另外用Plac是没什么道理的，这个promoter不是个很好地promoter（乱起八糟调控太多，strength和leaky都不明，我觉得相 ...

恩，那我可以尝试下pKD46了，看看效果如何
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31楼2013-11-19 15:36:22
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guohuayin

木虫 (著名写手)

博士，副教授

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。
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内生菌资源和核酸分子的利用
2楼2013-11-01 20:29:45
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guohuayin at 2013-11-01 20:29:45
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。

你好，看过您的帖子了，对您的工作表示惊喜。我目前的情况是抗性基因PCR片段量应该够了，感受态也是按照文献方法做的，菌株就是常用的BW25113，引物设计50+20bp，转化后在抗性平板上长的挺多的，但全是假阳性，因此想请教一下有什么需要注意或者可能会影响重组效率的步骤，谢谢！
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3楼2013-11-01 21:09:04
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guohuayin at 2013-11-01 20:29:45
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。

还有一个就是，我想敲除的是三个串联基因，大小在2.5kb，应该说也不是很大了，不知道这个会有影响么。另外一个就是我使用的是四环素抗性基因片段，以前这个抗生素也没用过，所以对它的使用注意事项也不是很清楚，如果是抗性失效的话，长出假阳性也就可以理解了，但同时我做DH5a对照是没有菌落长出来的，因此重组效率不高应该是主要问题了，当然，四环素使用注意事项也烦请老师指点一二，谢谢！
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4楼2013-11-01 21:17:33
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
tet要避光'，你实验步骤至少要写清楚吧，不然问题多了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2013-11-01 22:45:42
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-01 22:45:42
tet要避光'，你实验步骤至少要写清楚吧，不然问题多了

1、将PKD46化转到大肠杆菌中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：50转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入阿拉伯糖至终浓度0.2%,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞，10%甘油洗涤。
2、将打靶分子（Tet抗性）>100ng左右（同源臂50bp），2500V电转至感受态中，30度培养2h后，涂布于Tet抗性的LB平板，37度过夜培养。

你说的Tet避光才开始我不知道，但是同时做了DH5a的对照没有长出菌落，因此抗性是存在的或者说操作对其影响不是很大。然后PCR完后没有经过DpnI处理而是跑胶回收的，在长出的菌落里提质粒没有发现模板质粒的存在，因此这步也应该不是问题吧。导入的抗性基因片段之前是PCR量太少，后面换了酶回收以后取0.5ul就能够达到和Marker差不多的量度了，而且这样我还是大量回收然后共沉之后电转的。我能想到的就是这些了，谢谢！
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6楼2013-11-02 00:05:54
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
另外看抗性失效或者有没有质粒污染，你应该做一组不诱导+DNA电转。
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8楼2013-11-02 04:03:48
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-02 02:13:19
反正我最开始用tet做过  后来觉得问题太多（你假的菌落是不是比正常的小？ BW25113长的很快的，菌落比dh5alpha也大很多）
直接换其他抗性了，Kan clora spec都不会长假的，就是clora可能选择压力略大，不过长出来的 ...

我也觉着tet抗性问题好多，好像环境中抗tet的菌也挺多的，当时这个抗性选择失误了，但是现在不是尽量用这个做成功吧，要不不好跟老板交代了。挑选菌落我是大的小的都挑了，而且挑的应该很多了吧，要么就是运气实在不佳，全是假阳性了。空白对照我做DH5a看抗性，还有未电转的感受态涂板也是没有菌落的，实在是想不明白哪里出问题了。
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9楼2013-11-02 11:52:55
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-11-04 08:36:28
你要做电转+不诱导，这样才能保证没有质粒污染。
还有一点，你目标基因是啥。。  不是housekeeping或者有很高选择压力的吧。。   另外你确定假阳性方法是什么？  目标菌里面能不能P出TetR
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10楼2013-11-02 14:28:36
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