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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Red重组老是不成功，求救
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山水88

木虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-02 14:28:36
你要做电转+不诱导，这样才能保证没有质粒污染。
还有一点，你目标基因是啥。。  不是housekeeping或者有很高选择压力的吧。。   另外你确定假阳性方法是什么？  目标菌里面能不能P出TetR

今天又提取了假阳性的质粒，出现了Tet模板质粒。。。。我没有用DpnI处理PCR产物，以为胶回收就可以把质粒除去了，自以为是害死人呀，你说的电转+不诱导是非常有必要的，谢谢你了，等后面再有问题了向你请教！
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21楼2013-11-03 18:35:14
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
另外抗生素浓度一般要低于正常选择浓度
比如clora，一般选择培养可以选择34-50
但是如果是基因组操作，选择一步一般用5-10
Tet是5还是10的我记不清了，反正是更容易失效了。
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22楼2013-11-03 22:15:22
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-03 22:15:22
另外抗生素浓度一般要低于正常选择浓度
比如clora，一般选择培养可以选择34-50
但是如果是基因组操作，选择一步一般用5-10
Tet是5还是10的我记不清了，反正是更容易失效了。

恩，我用的10，文献中也是这个浓度，谢谢你啦，过两天看能到那里，有问题再向你请教啦
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23楼2013-11-03 22:21:47
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山水88

木虫 (正式写手)
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22楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-03 22:15:22
另外抗生素浓度一般要低于正常选择浓度
比如clora，一般选择培养可以选择34-50
但是如果是基因组操作，选择一步一般用5-10
Tet是5还是10的我记不清了，反正是更容易失效了。

你好，又打扰您了，做了两个周还是没有得到正确菌株，我没有用DpnI处理，而是找了抗性片段之外的两个酶切位点对质粒进行了双酶切，由于之前以质粒为模板的PCR产物还有很多，我就对它们进行了过夜双酶切后核酸共沉转化，平板上长的菌落已经很少了，有的几乎一两个，但是挑选的经过菌落PCR验证（引物为敲除基因当中序列），结果还是有片段P出来了，与对照一致的，做的电转+不诱导是没有菌落产生的，后面挑选了几株进行了质粒检测其中一株是有模板质粒的，可见质粒影响较大。所以接着我就直接先对质粒酶切再胶回收片段后进行PCR，结果平板上也是长出一两个菌落，但是菌落PCR还是与对照一致。。。。，质粒呢正在提取中。真不知道怎么办了，是必须要DpnI处理么还是怎么的，可是也有好多文献是说用线性片段进行PCR就可以了，麻烦您了，谢谢
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24楼2013-11-18 15:31:52
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
如果假阳性只有1-2个，我觉得是可以接受的（我一般不用dpnI，个人感觉dpnI控制假阳性效果比胶回收还差），如果你想继续降低，你可以胶回收后取一点重新PCR。

我觉得你现在关键问题是阳性一点没有，可以完整写一下你的步骤么
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25楼2013-11-18 23:01:19
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山水88

木虫 (正式写手)
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25楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-18 23:01:19
如果假阳性只有1-2个，我觉得是可以接受的（我一般不用dpnI，个人感觉dpnI控制假阳性效果比胶回收还差），如果你想继续降低，你可以胶回收后取一点重新PCR。

我觉得你现在关键问题是阳性一点没有，可以完整写一下 ...

你好，昨天先酶切后PCR的假阳性菌中还是有模板质粒的出现（随机挑了四个，一个非常明显有模板质粒），那就不知道其它几株菌没有质粒怎么会有Tet抗性呢？
下面是我的步骤（文献中所述方法）：

1）电转化重组质粒（SpeR抗性，IPTG诱导）进入所要敲除基因的菌株BW25113中，涂平板筛选其SpeR抗性菌落
2）将活化好的阳性菌落转接至SOB培养基（添加0.5%葡萄糖、100μg/mL SpeR及2mM IPTG）培养至OD600=0.6制备感受态
3）双酶切抗性质粒，以其线性片段为模板扩增TetR基因，胶回收纯化并核酸共沉
4）将PCR产物电转入所制感受态中，添加1mL SOB培养基中复苏至少2h，取500μL涂布LB平板（添加0.5%葡萄糖、100μg/mL SpeR及10μg/mL TetR），30℃过夜培养后挑取菌落进行PCR验证。剩余500μL复苏至次日再涂布挑菌验证。
由于重组质粒后面要继续使用，所以一直保证它的存在，然后由于Mg2+对TetR的影响，我使用的是LB培养基而没有用SOB，谢谢！
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26楼2013-11-19 09:48:51
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
你重组质粒是哪个（哪篇文献）？重组酶的启动子是什么？   red系统是对细胞有毒的，你至少应该等OD到0.1再开始诱导（如果是PL系的启动子，诱导20min左右就可以了），另外2mMIPTG已经对细胞有些毒性了，SOB我没用过，但是葡萄糖对整个细胞代谢（蛋白质合成）是有影响的，另外OD=0.6有点偏高，0.4左右比较好

另外最后一步我没试过30°带原始质粒过夜，不过我觉得这样总是给细胞增加压力。
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27楼2013-11-19 10:12:10
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
至于假阳性，最好办法就是放弃使用tetR，换个抗性算上订引物也就一周工作时间，比在这干耗好多了，而且以后还能重复利用
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28楼2013-11-19 10:13:29
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山水88

木虫 (正式写手)
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27楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-19 10:12:10
你重组质粒是哪个（哪篇文献）？重组酶的启动子是什么？   red系统是对细胞有毒的，你至少应该等OD到0.1再开始诱导（如果是PL系的启动子，诱导20min左右就可以了），另外2mMIPTG已经对细胞有些毒性了，SOB我没用过， ...

文献是Kuhlman TE, Cox EC (2010) Site-specific chromosomal integration of large synthetic constructs. Nucleic Acids Res 38 (6):e92.启动子为PlacI,至于诱导时间我是觉得诱导时间长点重组酶的表达会好些吧，然后浓度什么的都是文献中的量了，他们加Glc也是为了抑制菌的生长而使质粒充分表达。之前我使用pKD13也是做了好久没做出来换了这套质粒的，现在看来Tet的使用问题应该解决了，就是现在重组效率低，我今天新制感受态再做一次看看。
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29楼2013-11-19 10:34:18
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
wtLAC promoter得话全程用LB培养基，Plac是Crp激活，LacI抑制，Crp是受cAMP（葡萄糖抑制）调控
另外用Plac是没什么道理的，这个promoter不是个很好地promoter（乱起八糟调控太多，strength和leaky都不明，我觉得相比pkd46用得pbad优势不大，其实真要有空这个优化起来也不难）。
做KO个人用过现成的里面pSIM19的效率最好（用得wtPL）
http://www.nature.com/nprot/jour ... nprot.2008.227.html
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30楼2013-11-19 11:40:07
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