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山水88木虫 (正式写手)
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[求助]
Red重组老是不成功，求救
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| 用Red重组敲除基因，做了一个多月了，还是没有成功，前期是抗性基因片段PCR量低，后来换了酶解决了，转了pKD46之后的菌株诱导表达到OD0.6制备感受态转化PCR片段，过程应该都是比较常规的了，可是这么久就是不成功，请问有做过的指点一下，谢谢了，浪费不起时间了 |
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山水88
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你好，又打扰您了，做了两个周还是没有得到正确菌株，我没有用DpnI处理，而是找了抗性片段之外的两个酶切位点对质粒进行了双酶切，由于之前以质粒为模板的PCR产物还有很多，我就对它们进行了过夜双酶切后核酸共沉转化，平板上长的菌落已经很少了，有的几乎一两个，但是挑选的经过菌落PCR验证（引物为敲除基因当中序列），结果还是有片段P出来了，与对照一致的，做的电转+不诱导是没有菌落产生的，后面挑选了几株进行了质粒检测其中一株是有模板质粒的，可见质粒影响较大。所以接着我就直接先对质粒酶切再胶回收片段后进行PCR，结果平板上也是长出一两个菌落，但是菌落PCR还是与对照一致。。。。，质粒呢正在提取中。真不知道怎么办了，是必须要DpnI处理么还是怎么的，可是也有好多文献是说用线性片段进行PCR就可以了，麻烦您了，谢谢 |
24楼2013-11-18 15:31:52
guohuayin
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【答案】应助回帖
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
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http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582 我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。 |
2楼2013-11-01 20:29:45
山水88
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3楼2013-11-01 21:09:04
山水88
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4楼2013-11-01 21:17:33