| 查看: 4189 | 回复: 49 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
山水88木虫 (正式写手)
|
[求助]
Red重组老是不成功，求救
|
||
| 用Red重组敲除基因，做了一个多月了，还是没有成功，前期是抗性基因片段PCR量低，后来换了酶解决了，转了pKD46之后的菌株诱导表达到OD0.6制备感受态转化PCR片段，过程应该都是比较常规的了，可是这么久就是不成功，请问有做过的指点一下，谢谢了，浪费不起时间了 |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有117人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
|
你好，又打扰您了，做了两个周还是没有得到正确菌株，我没有用DpnI处理，而是找了抗性片段之外的两个酶切位点对质粒进行了双酶切，由于之前以质粒为模板的PCR产物还有很多，我就对它们进行了过夜双酶切后核酸共沉转化，平板上长的菌落已经很少了，有的几乎一两个，但是挑选的经过菌落PCR验证（引物为敲除基因当中序列），结果还是有片段P出来了，与对照一致的，做的电转+不诱导是没有菌落产生的，后面挑选了几株进行了质粒检测其中一株是有模板质粒的，可见质粒影响较大。所以接着我就直接先对质粒酶切再胶回收片段后进行PCR，结果平板上也是长出一两个菌落，但是菌落PCR还是与对照一致。。。。，质粒呢正在提取中。真不知道怎么办了，是必须要DpnI处理么还是怎么的，可是也有好多文献是说用线性片段进行PCR就可以了，麻烦您了，谢谢 |
24楼2013-11-18 15:31:52
guohuayin
木虫 (著名写手)
博士，副教授
- 应助: 23 (小学生)
- 金币: 3338.8
- 散金: 265
- 红花: 17
- 帖子: 1521
- 在线: 101.7小时
- 虫号: 219355
- 注册: 2006-03-13
- 性别: MM
- 专业: 植物病理学
【答案】应助回帖
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
|
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582 我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。 |
2楼2013-11-01 20:29:45
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
3楼2013-11-01 21:09:04
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
4楼2013-11-01 21:17:33