| 查看: 4017 | 回复: 49 | |||
山水88木虫 (正式写手)
|
[求助]
Red重组老是不成功，求救
|
||
| 用Red重组敲除基因，做了一个多月了，还是没有成功，前期是抗性基因片段PCR量低，后来换了酶解决了，转了pKD46之后的菌株诱导表达到OD0.6制备感受态转化PCR片段，过程应该都是比较常规的了，可是这么久就是不成功，请问有做过的指点一下，谢谢了，浪费不起时间了 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 生物科学 |
» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有113人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
pET-22b构建好了质粒，表达不出来？
已经有7人回复- 大肠杆菌Red重组法基因敲除求助
已经有6人回复
- 基因敲除不成功
已经有10人回复
- Red重组中pKD3,pKD4,pKD46的抗性疑问
已经有6人回复
- 求助：重组质粒酶切问题！请大家帮我解决一下，急！
已经有7人回复
- 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
已经有16人回复
- 【求助/交流】细菌同源重组的同源臂最少需要多少bp呢？
已经有7人回复
- 【求助/交流】重组菌表达蛋白量如何测定？
已经有5人回复
- 【求助/交流】重组蛋白融合标签的选择
已经有6人回复
- 【求助/交流】对于BL21，含有那种形态的重组质粒多则诱导表达量高呢？超螺旋？线性？�
已经有7人回复
- 【求助/交流】带GST标签的重组蛋白的纯化？
已经有14人回复
- 【求助/交流】重组质粒转化
已经有22人回复
- 【求助/交流】重组质粒PCR的taq酶选择！
已经有11人回复
- 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题
已经有23人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
山水88: 金币+20 2013-11-03 17:43:17
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。从根本去入手 2013-11-04 08:35:42
山水88: 金币+15, 终于成功了，谢谢您的帮助！ 2013-12-09 21:50:22
感谢参与，应助指数 +1
山水88: 金币+20 2013-11-03 17:43:17
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。从根本去入手 2013-11-04 08:35:42
山水88: 金币+15, 终于成功了，谢谢您的帮助！ 2013-12-09 21:50:22
|
反正我最开始用tet做过 后来觉得问题太多（你假的菌落是不是比正常的小？ BW25113长的很快的，菌落比dh5alpha也大很多） 直接换其他抗性了，Kan clora spec都不会长假的，就是clora可能选择压力略大，不过长出来的都是一定有抗性的，另外重组质粒用psim19效率比pkd46高差不多一个数量级（pBad其实是个比较烂的诱导promoter）。 Ara0.2%差不多是10mM还多了，06年有文章说这个略微有点高（其实高浓度的Ara对E coli有点毒性），不过这个和诱导时间有关，我是OD=0.1诱导后1hr的。 |
7楼2013-11-02 02:13:19
13楼2013-11-02 15:25:13
16楼2013-11-02 22:53:02
guohuayin
木虫 (著名写手)
博士，副教授
- 应助: 23 (小学生)
- 金币: 3338.8
- 散金: 265
- 红花: 17
- 帖子: 1521
- 在线: 101.7小时
- 虫号: 219355
- 注册: 2006-03-13
- 性别: MM
- 专业: 植物病理学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
山水88: 金币+10 2013-11-03 17:44:04
山水88: 金币+10 2013-11-03 17:44:04
|
这是我能想到的解决办法：我看你做的实验，不应该是抗生素失效的问题，不过四环素抗性确实不好用，你可以给朱老师索要其他抗性质粒做个对照试试，也许就做出来了。同时我建议你检查所用的所有的实验材料，重组质粒，包括菌株是否正确，我做重组时，都是一个一个材料核实，确保重组系统没有问题，有些问题是当时我自己都没有料想到的，觉得不应该出现的问题，但是就是出错了，（比如曾经碰到重组质粒出错，抗生素失效，而这些都是问题的关键）。总之，重组碰到的问题太多，细心才能解决所有的问题。 |
18楼2013-11-03 01:02:17
27楼2013-11-19 10:12:10
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
31楼2013-11-19 15:36:22
guohuayin
木虫 (著名写手)
博士，副教授
- 应助: 23 (小学生)
- 金币: 3338.8
- 散金: 265
- 红花: 17
- 帖子: 1521
- 在线: 101.7小时
- 虫号: 219355
- 注册: 2006-03-13
- 性别: MM
- 专业: 植物病理学
【答案】应助回帖
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
|
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582 我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。 |
2楼2013-11-01 20:29:45
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
3楼2013-11-01 21:09:04
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
4楼2013-11-01 21:17:33
5楼2013-11-01 22:45:42
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
|
1、将PKD46化转到大肠杆菌中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：50转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入阿拉伯糖至终浓度0.2%,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞，10%甘油洗涤。 2、将打靶分子（Tet抗性）>100ng左右（同源臂50bp），2500V电转至感受态中，30度培养2h后，涂布于Tet抗性的LB平板，37度过夜培养。 你说的Tet避光才开始我不知道，但是同时做了DH5a的对照没有长出菌落，因此抗性是存在的或者说操作对其影响不是很大。然后PCR完后没有经过DpnI处理而是跑胶回收的，在长出的菌落里提质粒没有发现模板质粒的存在，因此这步也应该不是问题吧。导入的抗性基因片段之前是PCR量太少，后面换了酶回收以后取0.5ul就能够达到和Marker差不多的量度了，而且这样我还是大量回收然后共沉之后电转的。我能想到的就是这些了，谢谢！ |
6楼2013-11-02 00:05:54
8楼2013-11-02 04:03:48
山水88
木虫 (正式写手)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2526.7
- 散金: 190
- 红花: 2
- 帖子: 389
- 在线: 280.6小时
- 虫号: 1071557
- 注册: 2010-08-09
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
9楼2013-11-02 11:52:55
10楼2013-11-02 14:28:36