Red重组老是不成功，求救 - 分子生物 - 综合其他 - 第5页小木虫论坛-学术科研互动平台

merry99

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42楼2015-03-04 10:48:53

山水88

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42楼: Originally posted by merry99 at 2015-03-04 10:48:53
我最近敲除，同源臂转入后，经抗性基因消除步骤，再挑取菌落，PCR鉴定，仍出现同源臂大小片段，不知为何？求解

同源臂转入后PCR验证正确不，PCR验证时，多弄几对引物，上下游和基因中间都扩增下保证实验结果

43楼2015-03-04 17:01:00

merry99

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44楼2015-03-09 14:18:50

mess10

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楼主我看你最开始用的是pKD46重组酶表达质粒，但是后面又在说pKD13，我想请问你一下，你最后成功敲除用的是pKD46还是pKD13呢？还有就是是不是阿拉伯糖诱导pBAD启动子效率比较低呢？谢谢

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45楼2015-10-12 17:22:56

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45楼: Originally posted by mess10 at 2015-10-12 17:22:56
楼主我看你最开始用的是pKD46重组酶表达质粒，但是后面又在说pKD13，我想请问你一下，你最后成功敲除用的是pKD46还是pKD13呢？还有就是是不是阿拉伯糖诱导pBAD启动子效率比较低呢？谢谢

pKD46是重组蛋白质粒，pKD13是抗性基因打靶质粒，两个都要用的呀，阿拉伯糖后面我们都用30mM足够了

46楼2015-10-12 21:30:46

山水88

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44楼: Originally posted by merry99 at 2015-03-09 14:18:50
同源臂转入后PCR验证正确，随后转入抗性基因消除质粒，经42度培养后，PCR鉴定，仍出现同源臂大小片段。

同源臂转入后PCR验证，我只用靠近上下游的在同源臂外侧的引物进行了鉴定，因为鉴定引物一般要设计在同源臂 ...

你在基因中间设计引物，用同源臂外侧和基因中间的扩增下，如果抗性基因在就可以扩增出片段，如果消除了就扩增不出来了呀。同源臂是肯定一直在的，它又不会被消除。

47楼2015-10-12 21:34:09

mess10

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46楼: Originally posted by 山水88 at 2015-10-12 21:30:46
pKD46是重组蛋白质粒，pKD13是抗性基因打靶质粒，两个都要用的呀，阿拉伯糖后面我们都用30mM足够了...

楼主你好，我的重组也遇阻了，现在我把我的实验步骤写出来再次麻烦你根据你的经验给我看看那些需要改进的：
1、将含有PKD46质粒的大肠杆菌按1：100转接至新鲜含有amp的培养基中，培养至OD600=0.2时加入阿拉伯糖至终浓度10mM,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞，dd水洗两次，10%甘油洗一次，10%甘油保存。
2、将目的片段（阿泊拉霉素抗性）>100ng左右（同源臂50bp），2300V电转至感受态中，加入1mlsoc 30度复苏培养1h后，涂布于阿泊拉霉素抗性的LB平板，30度过夜培养.

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48楼2015-10-14 11:07:49

山水88

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48楼: Originally posted by mess10 at 2015-10-14 11:07:49
楼主你好，我的重组也遇阻了，现在我把我的实验步骤写出来再次麻烦你根据你的经验给我看看那些需要改进的：
1、将含有PKD46质粒的大肠杆菌按1：100转接至新鲜含有amp的培养基中，培养至OD600=0.2时加入阿拉伯糖至 ...

单看步骤是正确的了，需要注意的是感受态尽量是新鲜制备的，目的片段浓度尽量高，然后就重复吧，总会成功的

49楼2015-10-14 15:33:44

mess10

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49楼: Originally posted by 山水88 at 2015-10-14 15:33:44
单看步骤是正确的了，需要注意的是感受态尽量是新鲜制备的，目的片段浓度尽量高，然后就重复吧，总会成功的...

好的，先谢谢啦！我再试试看，有问题再请教！

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50楼2015-10-14 22:37:48